RFLP技术在作物育种中的应用与展望

■高　欣　蔺　娜



RFLP技术在作物育种中的应用与展望

■高欣蔺娜

内容摘要：分子标记技术（简称MAS）已在人类、动物、植物以及微生物中得到了广泛应用，在众多的MAS技术中，RFLP是最早也是应用最为广泛的一种分子标记。为了更深入的了解RFLP技术及其发展方向，对德温特世界专利索引数据库（DWPI）中涉及利用该技术进行植物育种的相关专利进行了分析和研究，梳理了该技术的发展脉络以及研究现状，对于该技术未来的发展前景和展望，还有待于进一步的深入研究和分析。

关键词：分子标记RFLP专利分析

分子标记技术（简称MAS）诞生于20世纪80年代，目前已在人类、动物、植物以及微生物中得到了广泛应用。相较于林、渔、牧业，MAS在作物领域的应用更加广泛，研究者们引入了大量的资源用于发展分子标记图谱以及寻找分子标记与表现型之间关联性的研究。

在众多的MAS技术中，RFLP是最早也是应用最为广泛的一种分子标记。目前，其广泛用于植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。其原理是基于植物基因组DNA上的碱基经替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片段长度的多态性。对每一个DNA/酶组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。其具有共显性的特点，适于构建植物遗传图谱。其不足之处在于分析过程比较繁琐和花费昂贵，不能用于大批量杂交种的纯度鉴定；且RFLP必须经过Southern杂交，费时费力，对DNA多态检出的灵敏度不高。

为了更深入的了解RFLP技术及其发展方向，本文对德温特世界专利索引数据库（DWPI）中涉及利用该技术进行植物育种的相关专利进行了分析和研究。检索截止日期为2015年12月 31日，样本数量为800篇专利文献。

RFLP技术的发展

从图1中可以看出，RFLP作为第一代分子标记技术在很长一段时期内（1989-2002年）占有绝对的统治地位，1999年到达顶峰后申请量开始大幅下滑，在2007年小幅上涨后继续呈下降态势，直到近两年申请量已经以个位数计，这种现象的产生与RFLP技术本身的特点是分不开的。RFLP作为Botstein等于1980年提出的分子生物学最早的遗传标记技术，标记的数目多且稳定，可用于构建高密度的遗传图谱。但是，由于其分析过程比较繁琐和花费昂贵，费时费力，对DNA多态检出的灵敏度不高等原因，逐渐被研究人员所摒弃，其主导地位被之后发展起来的第二、三代分子标记技术所取代。

主要申请国及进入国

某一国家专利技术申请量的多寡从一定程度上代表了该国技术的发展水平，而专利申请的进入国家则代表了申请人对于专利技术的布局战略，这对于企业的国际化发展是非常重要的。因此，下面对RFLP专利技术的主要提出国和申请目标国进行分析和统计。

从图2和图3的申请量统计可见，在RFLP育种技术领域中，专利申请量最大的是美国，其次是日本、中国等，而这些主要的申请提出国在除本国之外其他各国的专利布局各有侧重。如图3所示，横坐标代表提出申请的国家，不同颜色的柱形代表其进入的申请目标国家。美国除了在本国提出专利保护申请之外，在其他上百个国家也提出了申请，包括澳大利亚、加拿大、中国、日本等国家，并且其中有相当比例的申请是通过PCT途径和EPO途径提出的。可见，美国对其RFLP育种技术在很多国家进行了专利布局（很多申请量较小的国家没有在图上标出），这也体现了美国对全球生物资源的一种“圈地运动”。

日本对RFLP育种技术提出的申请也进入了几十个国家，但主要是全球一些主要的农业国家，在其他比较小的国家布局较少，应该说侧重点更强一些。与美国布局特点一致的是，日本的布局重点是美国、欧洲地区、中国和澳大利亚等国。

与上述技术发达国家形成鲜明对比的是，中国仅在少数国家进行了布局，申请数量也较少，这种形势对于我国种子企业的国际化显然非常不利。当然其中存在客观原因，例如向国外提交专利申请并获得保护的费用不菲，对于我国大多数中小种子企业来说是很大的经济负担。但是，对于有能力在国外进行专利布局的大型企业来说，有必要借鉴国外大企业的布局模式，将自己的专利技术有目的地布局到全球主要农业国家或者目标市场国中，为向国际化跨国公司发展开拓道路。

主要申请人

从RFLP育种技术专利的主要申请人来看，杜邦（先锋）、迪卡（1998年被孟山都收购）、斯泰这三家排名前三位的公司，这说明了RFLP标记辅助育种技术目前主要掌握在这三家公司手里（图4）。

图1　历年RFLP技术专利申请量

图2　RFLP技术专利各国申请量分布

图3　RFLP技术专利在各国申请的国家分布

图4　RFLP技术主要申请人分布

杜邦公司成立于1802年，是目前世界500强企业中成立时间最早、资格最老的常青树。2011年，公司研发投入为20亿美元，拥有9500多名科学家和技术人员以及全球超过150家研发机构。目前，杜邦公司在全世界拥有21000多项有效专利以及超过15000项专利应用。在超过200年的公司历史中，凭借其雄厚的资本、先进的经营理念、贯彻始终的创新精神和不断扩展新领域的勇气，杜邦公司创造了属于自己的不败奇迹。农业领域是目前杜邦业务版图中的重要一环，虽然涉足育种领域比较晚，但凭借强大的综合实力，特别是在1999年全资并购当时美国育种行业的龙头企业——先锋国际良种公司以后，杜邦一跃成为全球最大的农业育种企业，并长期保持这一殊荣。

从图5中可以看出，杜邦（先锋）在该技术的研发上占有绝对的优势，不仅是开始最早的公司，在近十年来其他公司几乎没有针对该技术的专利申请的情况下，杜邦（先锋）仍然没有放弃对RFLP技术的研发。在RFLP技术20多年的发展历程中，杜邦（先锋）公司的申请量呈双峰式发展趋势。而申请量呈如此有规律的波动是与植物育种的周期性密切相关的。

迪卡公司曾经是美国第二大玉米企业，1998年被孟山都公司收购后，在RFLP育种技术的研究上投入了相当大的精力。但是，自2005年至今该公司并没有提出相关的申请，似乎已放弃了对该技术的研发。

美国斯泰（STINE）公司是一家“非著名”的私人种业公司，长期致力于作物育种。该公司对于RFLP育种技术的研发集中在2001-2003年，之后便没有针对该技术的申请。

RFLP技术在育种方面的应用

作为第一代分子标记技术，RFLP标记辅助作物育种所涉及的作物种类比较丰富，各作物的申请量也比较平均（图6），但涉及粮食作物：玉米、豆类作物的申请量依然较多，均为上百项；主要粮食作物：麦类、高粱和水稻的申请量也较多；经济作物：棉花；以及蔬菜作物：芸苔属植物的申请量也不在少数，均在30-50项之间。此外，烟草、番茄/茄子、向日葵、甜/辣椒、黄瓜、豌豆和薯类的申请量也在10项以上。可见，在RFLP发展的二十几年里已经被广泛应用于多种作物的育种技术中。

在RFLP技术发展的前十年，对于该技术的研究主要集中在玉米、豆类和芸薹属这3类作物中。从1999年起，分子标记技术得到了突破性发展，对于多种作物的RFLP育种研究技术也突飞猛进，其中玉米和豆类是研究的重点。在第二个十年中，麦类、水稻、高粱、芸薹属、烟草等作物的RFLP育种研究均得到了较大的发展，申请量激增。而在2004年之后，各类作物的申请量均有下降，近几年来已减少至每年10项以下，但是玉米和豆类的申请量始终比其他作物品种多。

图5　历年RFLP技术主要申请人申请量分布

图6　RFLP技术申请量各领域分布

图7　RFLP技术申请量（按性状分布）

图8　历年RFLP技术申请量（按性状分布）

图9　主要申请国申请量（按领域分布）

图10　主要申请国申请量（按性状分布）

图11　主要申请人申请量比例（按企业分）

作物多基因性状方面，如抗病和抗逆相关研究在多基因控制性状的发展最快。从图7和图8中可以看出，对作物抗性和单位面积产量的改良是研发热点，在1999-2012年间，育种研发人员的关注焦点一直是对作物抗性和产量方面的改良，特别是对产量性状RFLP标记的开发早在1989年就已经开始，并在2000年和2001年达到顶峰；此外，作物育性的改良、作物品质的提升也是重要的育种目标，与之相关的申请量仅次于抗性和产量改良。而关于抽穗期、株高、分蘖性状相关的RFLP专利申请量则远远没有抗性和产量的多，对这三个性状RFLP标记的研发也是间断性地进行，2001年是这三个性状RFLP标记研发的高峰期。而随着分子标记技术的更新换代，对于作物RFLP标记的研发势头在近几年已大幅下降。

如图9、10所示，在申请量排名前4位的主要申请机构中，美国的申请量最大，较侧重于玉米和豆类的研究，对于性状的研究主要集中在抗性、产量、品质和育性中；日本虽排名第二，但数量上远不及美国，对于RFLP技术的研究主要集中在水稻，并致力于抗性的提高；欧洲各国的申请量与日本相近，主要研究目标既包括玉米、水稻、麦类等粮食作物，也包括番茄等蔬菜作物，对于性状的改良也集中在抗性和育性的提高；而小麦作为中国重要的粮食作物，自然是研究的首要目标，并且，我国的申请更注重抗性和品质的提高。

在申请量排名前4位的主要申请人中，玉米的申请人主要为杜邦（先锋）和迪卡两家公司，而豆类的申请人则主要为美国斯泰公司，先正达公司则较侧重于玉米中RFLP的研究（图11）。

通过以上对RFLP育种技术相关的专利申请的初步分析，本文梳理了该技术的发展脉络以及研究现状，对于该技术未来的发展前景和展望，还有待于进一步的深入研究和分析。

参考资料

1.董秀文，等.RFLP分析在作物育种上的应用［J］.黑龙江农业科学，1994，（4）.

2.沈革志.RFLP在作物育种上的应用［J］.上海农业学报，1992，8，（2）.

3.郑康乐.分子标记在作物遗传育种中的应用［M］.南京：江苏省科学出版社，1991.

4.石运庆，牟秋焕，李鹏，等.DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用［J］.山东科学，2005，18（2）：22-28.

5.Halward T M，et al. RFLP map of peanut［A］.Phillips R L &Vasil I K. DNA -based markers in plants［C］，Nethelands：Kluwer Academic Publishers，1994，246-260.

（作者单位：国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心审查业务部；国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心医药生物发明审查部，专利审查员）