响应面法优化灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶液体发酵培养基的研究

徐莉莎，石彦国，秦可欣，何国庆（.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨　50076；.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州　30058）



响应面法优化灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶液体发酵培养基的研究

徐莉莎1，*石彦国1，秦可欣1，何国庆2
（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058）

摘要：通过对灵芝菌丝体进行液体深层发酵培养，用响应面法对其产β-葡萄糖苷酶的培养基进行了优化。在筛选碳源、氮源种类及浓度、单因素对灵芝产葡萄糖苷酶影响的基础上，利用中心组合试验设计获得灵芝菌株发酵产β-葡萄糖苷酶的最佳培养基为麦芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5，酶活3.18 U/mL，生物量可达3.01 g/100 mL。优化后的培养基与基础培养基相比，β-葡萄糖苷酶酶活和生物量分别提高了187%和160%，为利用灵芝菌丝体的微生物转化研究奠定了科学基础。

关键词：灵芝菌丝体；β-葡萄糖苷酶；响应面法

灵芝（Ganoderma Lucidum），隶属于担子菌纲、多孔菌目、灵芝菌科、灵芝属，是一种非常珍贵的食、药兼用真菌。灵芝的生理活性成分较多，主要有灵芝多糖、灵芝酸［1-2］，具有显著的抗肿瘤［3］、降血糖［4］、保肝［5］、抗病毒以及改善免疫系统功能等作用。灵芝液体深层发酵菌丝体的技术比子实体的生产周期短［6］、生产量大，容易控制。

β-葡萄糖苷酶（β- 1，4- glucosidase），是纤维素酵系的一个组成部分，能够将纤维二糖或其他可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子［7］，消除纤维二糖及纤维寡糖对葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的反馈抑制作用，显著提高纤维素酶的降解作用［8］。在国外已经出现用灰树花等食用菌的发酵液转化大豆异黄酮糖苷，与多糖进行复配用于治疗抗肿瘤［9］的研究。

本文采用响应面法提高1株现有灵芝菌株发酵液产β-葡萄糖苷酶的能力，确立一种有效的提高灵芝产β-葡萄糖苷酶酶活的培养基成分。利用单因素法和响应面法对其产酶发酵培养基成分进行优化，以得到利于产酶、成本较低且利用价值较大的培养基配方。

1　材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

赤芝（Ganoderma Lucidum），河南省科学院食用菌工程技术中心保藏；对硝基苯酚（pNP）、对硝基苯基-β- D-葡萄糖苷（pNPG）、酵母浸粉，阿拉丁试剂有限公司提供；PDA培养基、PDB培养基、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、VB1等，均为分析纯，均由国药集团化学试剂有限公司提供。

斜面培养基：PDA培养基；种子培养基（%）：PDB 3.5，蛋白胨0.5，酵母浸粉0.3，KH2PO40.3，MgSO40.15，VB10.005，pH值5.5；基础发酵培养基（%）：葡萄糖2，蛋白胨1，KH2PO40.3，MgSO40.15，VB10.005，pH值5.5。

1.2 方法

1.2.1菌种培养方法

（1）斜面培养。将保存在- 4℃的灵芝菌株28℃活化30 min，接种至斜面培养基上，放置于28℃生化培养箱中培养8～9 d至斜面长满菌丝为止。

（2）种子培养。经活化的斜面菌种接种到250 mL摇瓶中，装液量为100 mL，置28℃摇床中，以转速180 r/min，培养8 d。

（3）深层发酵培养。250 mL三角瓶中装100 mL发酵培养基，接种量为10%，置于28℃摇床中，以转速180 r/min，培养6 d。

1.2.2生物量测定

每次取1瓶发酵液抽滤，沉淀的菌丝体用蒸馏水清洗后离心，反复2次，菌体在60℃下烘干至恒质量，称得生物量。

1.2.3酶活测定

将经发酵6 d的发酵液抽滤，分离菌丝体和发酵液。发酵液稀释后用比色法测定胞外β-葡萄糖苷酶酶活，菌丝体经无菌水多次洗涤，测定胞内β-葡萄糖苷酶酶活，最后将胞内与胞外的酶活相加，即为灵芝深层发酵液总酶活。

采用比色法，以对硝基苯基-β- D-葡萄糖苷（pNPG）为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对硝基苯酚于400～420 nm可见光范围内有特征吸收峰，可直接于400～420 nm比色测定［10］。

1.3试验设计

1.3.1单因素试验

（1）碳源及碳源浓度。将基础发酵培养基中的碳源葡萄糖分别替换为麦芽汁、蔗糖、土豆、玉米粉和可溶性淀粉，在28℃，以转速180 r/min培养条件下，发酵培养6 d后测定灵芝菌丝体中β-葡萄糖苷酶酶活，从而确定适合灵芝菌丝体产酶的最佳碳源。在确定最佳碳源后，其他条件不变，做不同浓度的碳源试验。

（2）氮源及氮源浓度。基础发酵培养基中的氮源蛋白胨分别用等量的酵母浸粉、麸皮、豆粕煮汁、牛肉膏和硫酸铵代替，保持温度28℃，以转速180 r/min培养条件，发酵培养6 d后测定粗酶液中β-葡萄糖苷酶酶活，以确定适合灵芝菌丝体产酶的最佳氮源。在确定最佳氮源后，其他条件不变，做不同浓度的碳源试验。

1.3.2响应面试验

利用Design- Expert软件进行CCD中心组和试验设计，并对其结果进行方差分析。

CCD试验因素与水平设计见表1。

表1　CCD试验因素与水平设计　/%

2　结果与讨论

2.1单因素试验结果分析

2.1.1不同碳源对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

不同碳源对灵芝菌株发酵产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响见图1。

图1　不同碳源对灵芝菌株发酵产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

碳源是灵芝菌株生长过程中主要的营养成分，由图1可看出，不同碳源对灵芝菌株发酵产β-葡萄糖苷酶有不同的影响。当碳源为麦芽汁时，灵芝液体发酵所得生物量最高，可达到1.863 5±0.04 g/100 mL，酶活U为1.039 8±0.01 mL。

麦芽是啤酒生产中主要的原料，其主要成分有碳水化合物70%～85%，蛋白质10.5%～12.5%，无机物2%～4%，脂肪1.5%～2%；碳水化合物包括淀粉、单糖、纤维素、半纤维素等。本试验所用麦芽汁是根据EBC法，把麦芽糖化成麦芽汁，水解得到多种碳水化合物，包括麦芽糖、糊精、葡萄糖、可溶性的含氮物质、树胶及部分无机物，具有成本低廉、来源广泛的特点，更益于微生物培养及工业化生产。将麦芽糖化汁作为灵芝深层液体发酵碳源，以获得产β-葡萄糖苷酶的报道至今未见。

2.1.2氮源对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶的影响

氮源对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响见图2。

由图2可以看出，当氮源是豆粕煮汁时，酶活最高，可达到1.644 7±0.02 mL，豆粕作为价格低廉的工业废料，蛋白质含量高。而当酵母浸粉为氮源时，生物量显著增多，为1.900 4±0.04 g/100 mL。因此，为保证酶活较高水平的同时，提高生物量，选择豆粕煮汁和酵母浸粉最为复合氮源。

图2　氮源对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

2.1.3麦芽汁质量分数的影响

麦芽汁质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响见图3。

图3　麦芽汁质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

由图3可以看出，麦芽汁质量分数有5个梯度，分别为2%，4%，6%，8%，10%，随着麦芽汁质量分数的增加，菌丝酶活及生物量均有所提高。当麦芽汁质量分数为6%时，菌丝酶活和生物量达到最高，分别为2.986 3±0.04 U/mL，2.252 8±0.12 g/100 mL；但当麦芽汁质量分数为2%时，菌丝酶活和生物量分别降至1.864 7±0.05 U/mL，1.265 3±0.08 g/100 mL，主要是由于过高麦芽汁质量分数会引起过高的细胞渗透压，不利于菌丝生长。因此，选取4%～8%麦芽汁作为进一步试验的范围。

2.1.4豆粕煮汁质量分数的影响

豆粕煮汁质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响见图4。

由图4可以看出，豆粕煮汁质量分数有5个梯度，分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，菌体酶活和生物量都随着豆粕煮汁质量分数的升高而上升，生物量从1.5%开始无明显变化。因此，选取1.5%～2.0%的豆粕煮汁作为进一步试验的范围。

2.1.5酵母浸粉质量分数的影响

酵母浸粉质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响见图5。

图4　豆粕煮汁质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

图5　酵母浸粉质量分数对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶及生物量的影响

由图5可以看出，酵母浸粉质量分数有5个梯度，分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，菌体酶活随酵母浸粉质量分数的升高而显著升高，生物量从质量分数为1.0%开始维持到较高水平后无明显变化。因此，选取1.5%～2.5%的酵母浸粉作为进一步试验的范围。

2.2响应面试验结果分析

采用Central Composite Design响应面法优化灵芝液体发酵培养基［11］。

CCD试验设计及结果见表2。

菌丝酶活Y1与生物量Y2的多项式回归方程如下：

Y1=3.13+0.17A+0.088B- 0.027C- 0.19AB+ 6.25AC+0.004 1BC- 0.25A2- 0.27B2- 0.26C2.

Y2=2.89+0.17A- 0.11B- 0.069C+0.016AB+ 6.25AC- 3.75BC- 0.11A2- 0.15B2- 0.16C2.

二者模型p<0.000 1，说明二次回归模型是显著的，拟合程度较好，预测值与实测值之间有高度的相关性，可以应用于β-葡萄糖苷酶生产的理论预测。

用Design- Experts软件绘制出响应面分析图，固定其中1个变量，研究其他2个变量的交互作用对各响应值的影响。

各因素交互影响灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的响应面见图6，各因素交互影响灵芝生物量的响应面见图7。

由图6和图7可以看出，响应面均为开口向下，说明响应值在试验变化范围内存在极高值。根据图6的曲面图，培养基中麦芽汁对酶活的影响最为显著，曲线较陡。根据等高线图，麦芽汁与豆粕煮汁质量分数对灵芝菌株酶活的交互影响作用最为显著，等高线最密集。随着麦芽汁、豆粕煮汁和酵母浸粉质量分数的增加，菌丝酶活和生物量均会随之增加，但是过高的质量分数会抑制菌丝生长，其酶活也会随之减少。

表2　CCD试验设计及结果

试验模型预测：当麦芽汁质量分数7.10%，豆粕煮汁质量分数1.62%，酵母浸粉质量分数1.93%时，菌丝酶活及生物量分别可达到3.142 5 U/mL，2.973 5 g/100 mL。将预测结果进行3次重复验证试验，所得菌丝酶活及生物量分别为3.18±0.06 U/mL，3.013 6±0.79 g/100 mL，与预测值接近，表明该模型对于优化灵芝发酵培养基具有可行性。因此，将麦芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5作为高产β-葡萄糖苷酶灵芝菌株的液体发酵培养基条件。

3　结论

图6　各因素交互影响灵芝产β-葡萄糖苷酶酶活的响应面

图7　各因素交互影响灵芝生物量的响应面

本研究采用响应面分析法，对灵芝菌株产β-葡萄糖苷酶的深层发酵培养基进行优化，效果显著。确定了最佳发酵培养基配方为麦芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5，使得β-葡萄糖苷酶酶活和生物量分别提高了187%和160%，并首次采用麦芽汁作为培养灵芝发酵液的碳源，以提高β-葡萄糖苷酶酶活。同时，说明用响应面法优化灵芝菌丝体产酶的培养基是有效可行的。

参考文献：

［1］Tang Y J，Zhong J J. Modeling the kinetics of cell growth and ganoderic acid production in liquid static cultures of the medicinal mushroom Ganoderma Lucidum［J］. Biochemical

Engineering Journal，2004，21（3）：259-264.

［2］Qiao Y，Zhang X M，Qiu M H. Two novel lanostane triterpenoids from ganoderma sinense［J］. Molecules，2007，12（8）：2 038-2 046.

［3］Zhao W，Xu J W，Zhong J J. Enhanced production of ganoderic acids in static liquid culture of Ganoderma Lucidum under nitrogen -limiting conditions［J］. Bioresour Technol，2011，102（17）：8 185-8 190.

［4］Guo X Y，Liu D，Ye M，et al. Structural characterization of minor metabolites and pharmacokinetics of ganoderic acid C2in rat plasma by HPLC coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］. J Pharm Biomed Anal，2013，75：64-73.

［5］KimH M，Paik S Y，Ra K S，et al. Enhanced production of exopolysaccharides by fed-batch culture of Ganoderma resinaceum DG-6556［J］. Journal of Microbiology，2006，44（2）：233-242.

［6］Erkel E Iclal. Yield performance of Ganoderma Lucidum（Fr.）karst cultivation on substrates containing different protein and arbohydrate sources［J］. African Journal of Agricultural Research，2009，4（11）：1 331-1 339.

［7］Lynd L，Weim P J，Willem Z，et al. Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology［J］. Microbiol Mol Biol Rev，2002，66：506-517.

［8］Bayer E A，Chanzy H，Lamed R，et al. Cellulose，cellulases and cellulosomes［J］. Curr Opin Struct Biol，1998，8（5）：548-557.

［9］Yuan L，Chihiro W，Sun Buxiang，et al. The role of βglucuronidase in induction of apoptosis by genistein combined polysaccharide（GCP）in xenogeneic mice bearing human mammary cancer cells［J］. Annals New York A－cademy of Science，2003（10）：347-349.

［10］李华，高丽.β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展［J］.食品与生物技术学报，2007（2）：78-81.

［11］山琳，张卫兵，梁琪，等.响应面法优化米曲霉产β-半乳糖苷酶固体发酵培养基［J］.食品工业科技，2013，34（17）：189-192.◇

Optimization of the Medium Composition for Production of β- glucosidase by Ganoderma Lucidum Using Response Surface Methodology

XU Lisha1，*SHI Yanguo1，QIN Kexin1，HE Guoqing2
（1. Food Science and Engineering College，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2. College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310058，China）

Abstract：Optimization of the medium composition for production of β- glucosidase by Ganoderma Lucidum is studied in this article. Effect of the type and concentration of carbon and nitrogen source is investigated. Based on the result，the response surface methodology is used to optimize the medium and the result listed as follows：malt extract 7.10%，bean pulp 1.62%，yeast extract 1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH 5.5. Under these conditions mycelial biomass and β- glucosidase activities in the fermentation mycelia achieved at 3.38 U/mL，3.01 g/100 mL，and increased by 187%，160% respectively compared with the basic medium，which laid the foundation for the further study of Ganoderma Lucidum bioconversion.

Key words：Ganoderma Lucidum；β- glucosidase；response surface methodology

中图分类号：Q815

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.031

文章编号：1671- 9646（2016）04b- 0006- 04

收稿日期：2016- 03- 17

作者简介：徐莉莎（1988—），女，在读硕士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

*通讯作者：石彦国（1960—），男，硕士，教授，研究方向为大豆加工技术。