挤压超声联用提取的米糠多糖结构研究

王　霞，崔晓彤，李凡姝，许　青，杨　柳，肖志刚，3（.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳　0034；.沈阳师范大学化学化工学院，辽宁沈阳　0034；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨　50030）



挤压超声联用提取的米糠多糖结构研究

王霞1，崔晓彤2，李凡姝1，许青1，杨柳1，*肖志刚1，3
（1.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034；2.沈阳师范大学化学化工学院，辽宁沈阳110034；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

摘要：将米糠多糖粗液通过乙酸锌－亚铁氰化钾法脱除蛋白质得到的米糠多糖，用超滤技术分离纯化得到抗氧化活性最为显著的米糠多糖（RBS-Ⅱ）。采用高效液相凝胶渗透色谱法、光谱分析以及透射电镜研究了RBS-Ⅱ的结构。结果表明，米糠多糖的分子量分布比较均匀；红外光谱分析可知，多糖中存在α-糖苷键和β-糖苷键2种构型，含有酸性基团和蛋白质基团；通过透射电镜观察可知，多糖在水溶液中多个糖链缠绕成股，每条多糖链自身发生扭曲缠绕，进而形成不同形状的聚集体。

关键词：米糠多糖；高效液相；光谱；透射电镜；超滤

0　引言

我国是稻谷生产大国，稻谷碾白后的副产品——米糠，占稻谷总质量的5%～7%，每年我国米糠的产量均超过1 000×104t［1-2］，所以有特别丰富的米糠资源。米糠中营养物质比较丰富，但是绝大部分的米糠都被用作动物饲料，导致米糠资源未能得到合理的利用。虽然我国对米糠的加工利用率很低，但是世界上许多发达国家从上个世纪就开始了米糠的研究利用，并且研究技术已经达到了一个很高的水平，利用米糠生产一些价值较高的产品，如米糠蛋白、米糠油、米糠多肽、植酸、谷维素和功能性膳食纤维等［3］。

米糠中的营养成分——米糠多糖的研究比较广泛，它主要由葡萄糖通过α- 1，6糖苷键连接而成的一种杂聚糖。日本学者在研究米糠时发现了一些功能活性，这些功能活性的主要成分就是米糠多糖，之后便有学者开始对米糠多糖进行深入的研究［4］。米糠多糖有保健功能、显著的生物活性和膳食纤维所具有的生理功能，而且米糠多糖在抗肿瘤、免疫增强、抗细菌感染、降血糖及降血脂等方面也具有较高的生物活性［5-8］，通过对米糠多糖进一步的研究，以开拓米糠多糖应用的新领域。

本文对超滤技术分离纯化后的活性米糠多糖RBS-Ⅱ的结构、组分和形貌特征进行研究，为米糠多糖的深入研究及其应用提供重要理论依据。

1　材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

通过挤压超声联用，提取米糠多糖的最佳工艺参数制得米糠多糖粗液［9］，米糠多糖得率7.18%。将得到的米糠多糖粗液经乙酸锌-亚铁氰化钾法脱除蛋白质，并通过超滤技术分离纯化得到较高活性的米糠多糖RBS-Ⅱ［10］。

考马斯亮蓝G- 250，国药集团化学试剂有限公司产品；三氯乙酸，成都科龙化学试剂厂产品；Agilent 1100型高效液相色谱仪，America公司产品；GC- 2010型气相色谱仪，日本岛津公司产品；VERTEX型傅里叶红外光谱仪，德国Bruker公司产品；JEM- 1200EX型透射电子显微镜，日本日立公司产品；TU- 1800型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；DF110型电子分析天平，中国轻工机械总公司常熟衡器工业公司产品。

1.2 方法

1.2.1米糠多糖RBS-Ⅱ纯度的鉴定

多糖属于大分子化合物，通常由不同分子量多糖组成。因此，多糖的纯度并不是指单纯的某一种物质，而是在一定范围内的均一组分，即便是纯品其纯度也是不均一的［11］。

配置米糠多糖待测液，用0.45 μm微孔过滤膜过滤，取过滤液2 mL过Sephadex G- 100型柱，用水溶液洗脱，10 mL /管，用苯酚-硫酸法进行跟踪检测，于波长490 nm下测得的吸光度对洗脱管数作图，得到洗脱曲线。

1.2.2高效液相凝胶渗透色谱法测定米糠多糖分子量

米糠多糖溶解于流动相中，经微孔过滤膜过滤后供进样。在测定过程中，选用TSK型和UltrahydrogelTMLinear型（300 mm×7.8 mm ID×2）色谱柱双柱串联，利用Waters- 2410型示差折光检测器进行检测，测得流动相为0.1 mol/L的硝酸钠，流速为0.9 mL/min，柱温为45℃，进样量为20 μL，并且记录样品的色谱曲线。在相同条件下按照HPLC将7种相对分子量为1 800，4 600，21 400，41 100，133 800，2 000 000的标准Dextran相继进样，并且记录每种样品的保留时间tR，然后以tR为横坐标、LgM为纵坐标，画出标准曲线。在相同的试验条件下得到样品RBPS2a的色谱曲线，最后选用Millennium 2010（Waters）软件分析该样品的保留时间，最终得到了样品的相对分子量［12］。

1.2.3多糖样品中单糖组成分析

（1）多糖水解。称取多糖样品5 mg，加入3 mL 的2 mol/L三氯乙酸。120℃下水解4 h，取出，加入少量的甲醇，充氮气至挥发蒸干，以除尽三氯乙酸，得到多糖水解物。

（2）单糖的乙酰化。分别在单糖标准品和多糖水解产物中，加入0.5 mL无水吡啶，2 mg的肌醇六乙酰酯，10 mg的盐酸羟胺，90℃下水解30 min，取出后冷却。在冷却后的溶液中加入0.5 mL无水乙酸酐，90℃下进行30 min乙酰化，得到多糖的糖腈乙酸酯衍生物经微孔过滤膜过滤，滤液直接进样，进行气相色谱分析。

（3）色谱柱条件。色谱柱为石英毛细管柱（30 m×0.25 mm），载气N2，流速1.2 mL/min，H230 mL/min，空气300 mL/min；进样温度280℃，FID检测器温度260℃，柱温150℃；升温程序0 min→7℃/min→190℃，0 min→15℃/min→250℃，2 min，进样量0.5 μL［13-15］。

1.2.4光谱分析

（1）紫外可见光光谱分析。将制得的多糖样品配成2 mg/mL的溶液，以蒸馏水作空白对照，于400～190 nm进行全波长紫外扫描。取0.2 mL上述溶液，加入0.4 mL 5%苯酚和2 mL浓硫酸，以0.2 mL蒸馏水加0.4 mL 5%苯酚及2 mL浓硫酸为空白对照，于700～190 nm进行全波段扫描［16］。

（2）红外光谱分析。米糠多糖的黏度较大并且吸湿性特别强，无法在红外光灯下与KBr进行混合研磨。所以，首先要将多糖样品配成2 mg/mL的溶液后进行红外光谱的扫描。方法见参考文献［17］。

1.2.5形貌特征分析——透射电镜（TEM）观察

配置质量浓度为0.01 mg/mL的样品溶液，将其蘸在涂有碳膜的铜网上，静置15 min，再用醋酸铀染色15 min，避光放置25 min，在H- 7650型透射电子显微镜观察拍照。

2　结果与分析

2.1米糠多糖RBS-Ⅱ纯度的鉴定

米糠多糖RBS-Ⅱ经Sephadex G- 100型凝胶柱层析，最终得到的洗脱曲线中并不是由单一对称峰组成，从而证明RBS-Ⅱ不是单一组分。在洗脱曲线中也有一个相对主峰，说明米糠多糖的纯度相对较高。

RBS-Ⅱ在Sephadex G- 100型层析柱上的色谱见图1。

2.2多糖分子量的测定

图1　RBS-Ⅱ在Sephadex G- 100型层析柱上的色谱

米糠多糖RBS-Ⅱ的相对分子量见表1。

表1　米糠多糖RBS-Ⅱ的相对分子量

在结构分析之前需要对分离纯化后活性组分RBS-Ⅱ的相对分子量做出鉴定，本研究采用高效液相凝胶渗透色谱法测定了RBS-Ⅱ的相对分子量，测得RBS-Ⅱ的数均分子量Mn为72 912 Da，重均分子量Mw为73 492 Da，多分散系数Mw/Mn为1.007。Mw/Mn值接近1.0，RBS-Ⅱ的Mw/Mn值为1.007，说明RBS-Ⅱ的相对分子量分布较均匀。

2.3多糖样品中单糖组成分析

单糖标样的糖腈乙酰化气相色谱见图2，RBS-Ⅱ样品单糖的糖腈乙酰化气相色谱见图3。

图2　单糖标样的糖腈乙酰化气相色谱

图3　RBS-Ⅱ样品单糖的糖腈乙酰化气相色谱

本试验结果与相关文献报道米糠多糖的单糖组成木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比约为2∶4∶1∶4，有较大差别，这可能是由于米糠提取工艺不同。本试验采取挤压联合超声提取米糠多糖，而文献中采用热水浸提法，挤压和超声等物理破碎作用使得单糖组成差别较大；本试验的原料采用东北地区的稻米副产物，而文献中的原料采用华南地区的稻米副产物，水稻品种的差异也可能造成米糠中多糖的单糖组成有一定的差别。

2.4光谱分析

2.4.1紫外光谱分析

米糠多糖RBS-Ⅱ的紫外光谱见图4，米糠多糖RBS-Ⅱ经苯酚-硫酸显色后的紫外光谱见图5。

图4　米糠多糖RBS-Ⅱ的紫外光谱

图5　米糠多糖RBS-Ⅱ经苯酚-硫酸显色后的紫外光谱

由图4所示，米糠多糖RBS-Ⅱ水溶液在190～400 nm波长范围扫描，扫描光谱结果表明，在波长285 nm附近有弱吸收，说明RBS-Ⅱ中含有蛋白质成分，在前面试验中米糠多糖中没有游离蛋白质的存在，所以可以判定，米糠多糖中含有一定量的多糖-蛋白质结合物。而大量的研究证明，很多的糖蛋白在细胞表面有一定的识别作用，也存在抗原抗体的结合。如图5所示，RBS-Ⅱ的水溶液在经苯酚-硫酸溶液显色后，在490 nm附近产生了强特征吸收峰，从而说明了该提取物是一种多糖。

2.4.2红外光谱分析

米糠多糖RBS-Ⅱ的红外光谱见图6。

红外光谱法（IR）是研究有机化合物分子结构的一种极其重要方法，通常是根据多糖的特征吸收峰来鉴多糖的某些基团。米糠多糖的红外光谱研究发现，在3 400 cm-1出现的宽峰是多糖分子内或分子间氢键O- H伸缩振动的表现；2 932 cm-1和1 839 cm-1出现的吸收峰分别是C- H伸缩振动和边角振动引起的，以上吸收峰构成了多糖的特征吸收峰。在1734cm-1附近为羧基的特征吸收峰，表明多糖中可能存在酸性基团，含有一定量的糖醛酸，这与前面测定结果一致；在N- H变角振动区1 650～1 550 cm-1有明显的蛋白质吸收峰，表明该样品是多糖-蛋白质复合物，与前面试验结果相符；在1 200～1 000 cm-1范围内2个吸收峰1 020 cm-1和1 161 cm-1是C- O伸缩振动引起的；在840 cm-1和890 cm-1附近有2个明显的吸收峰，表明多糖中存在α-糖苷键和β-糖苷键2种构型。

图6　米糠多糖RBS-Ⅱ的红外光谱

2.5形貌特征分析——透射电镜（TEM）观察

米糠多糖RBS-Ⅱ透射电镜见图7。

图7　米糠多糖RBS-Ⅱ透射电镜

图7（a）显示了米糠多糖分子螺旋盘绕的形貌。米糠多糖是大分子化合物，结构比较复杂，多糖分子链并非单个糖链，由于多糖中还含有糖醛酸，1个糖链上羧基负离子的强电负性氧原子或糖醛酸羧基会与另一个链上羟基易发生糖链间氢键的缔合，从而会形成多个糖链缠绕成股的多糖链。同时，由于每个多糖分子内部也可形成分子内氢键，自身发生扭曲缠绕，进而形成不同形状的聚集体，每个聚集体单独游离于溶液中。

图7（b）显示了在稀溶液中米糠多糖分子呈柏树枝状聚集态，因为多分子或分子集团聚集成不同式样的束会形成这种聚集的状态，通常这种聚集状态会有1个或几个相对的向外辐射，这种结构在多糖中具有普遍性，它是多糖在稀溶液中的四级结构。

3　结论

分离纯化后的米糠多糖纯度不高，在进行纯度鉴定时，有2个较大的波峰，在紫外扫描也有蛋白质的波峰，但考马斯亮蓝反应为阴性，所以判定存在多糖-蛋白质的络合物。在红外光谱扫描分析中，米糠多糖中存在α-糖苷键和β-糖苷键2种构型，含有酸性基团和蛋白质基团。通过透射电镜观察发现，多糖在水溶液中多个糖链会缠绕成股形成多糖链，同时每条多糖链还会自身发生扭曲缠绕，进而形成不同形状的聚集体。

参考文献：

［1］姚惠源，周素梅，王立，等.米糠与米糠蛋白质的开发与利用［J］.无锡轻工大学学报，2002，21（3）：312-316.

［2］顾华孝.米糠的食用性和在保健功能食品上的应用［J］.粮食与饲料工业，2001（5）：46-48.

［3］王世宽，郭春晓，任路遥，等.米糠的功能及其在食品中的应用［J］.农产品加工，2007（1）：24-25.

［4］李传普，丁升艳，陈安国.米糠多糖的开发及应用［J］.饲料工业，2007，28（13）：55-57.

［5］青江诚一朗.米糠半纤维素［J］.日本酿协会志，1994，89：48-50.

［6］Tanigami Y，Kusumoto S，Nagao S，et al. Partial degradation and biological activities of an antitumor polysaccharide from rice bran［J］. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1991，39（7）：1 782-1 787.

［7］Yamagishi T，Tsuboi T，Kikuchi K，et al. Potent natural immunomodulator，rice water-soluble polysaccharide fractions with anticomplementary activity［J］. Cereal Chemistry，2003，80（1）：5-8.

［8］Takeo S，Kado H，Yamamoto H，et al. Studies on an antitumor polysaccharide RBS derived from rice bran. II. Preparation and general properties of RON，an active fraction of RBS［J］. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1988，36（9）：3 609-3 613.

［9］李杰，罗志刚，肖志刚，等.挤压超声联用提取米糠多糖工艺优化［J］.农业机械学报，2013，44（3）：46-48.

［10］肖志刚，李杰，王鹏，等.挤压超声联用提取的米糠多糖分离纯化研究［J］.沈阳师范大学学报（自然科学版），2015，33（1）：47-53.

［11］陈哲超，林宇野，谢必峰，等．复合酶解法提取香菇多糖蛋白的研究［J］．生物工程进展，1995，15（1）：47-50．

［12］张潇艳.米糠多糖的提取、纯化及结构研究［D］.无锡：江南大学，2008.

［13］欧阳臻，陈钧，李永辉.桑叶多糖的分离纯化及组成研究［J］.食品科学，2005，26（3）：181-184.

［14］Englyst H N，Quigley M E，Hudson C J．Determination of dietary fibre as non-starch polysaccharides with gas-liquid chromatographic，high-performation liquid chromatographic or spectrophotometric measurement of constituent sugars［J］．Analyst，1994，119：1 497-1 509．

［15］Mc Ginnis C D．Preparation of aldonoitrile acetates using N-methylimidazole as catalyst and solvent［J］．Carbohydrate Research，1982，108：284-292．

［16］刘贝贝.酸提菜籽饼粕多糖的研究［D］.武汉：华中农业大学，2007.

［17］王斌，萱垣昇，李杰芬.灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作用［J］.免疫学杂志，2006，22（3）：283-285.◇

Research on Structure of Rice Bran Polysaccharide by Extrusion in Conjunction with Ultrasound

WANG Xia1，CUI Xiaotong2，LI Fanshu1，XU Qing1，YANG Liu1，*XIAO Zhigang1，3
（1. College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China；3. College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

Abstract：In this paper，the crude rice bran polysaccharide as the material is studied that the removal of the rice bran polysaccharide protein in it by the method of zinc acetate- potassium ferrocyanide. And use high performance liquid gel permeation chromatography，spectroscopy and transmission electron microscopy to study the antioxidant activity of the most significant structural RBS-Ⅱ. The results show that the molecular weight of rice bran polysaccharide is more evenly distributed. Polysaccharides contain two conformations of α- glycoside bonds and β- glycoside bonds，respectively containing an acidic group and a protein group by infrared analysis. The experiment shows a plurality of sugar chains wound into strands in the aqueous solution，each polysaccharide chain wrapped and distorted，thereby formed aggregates of different shapes through a transmission electron microscope（TEM）.

Key words：rice bran polysaccharide；high performance liquid gel chromatography；spectrum；TEM；ultrafiltration technology

中图分类号：TS210.9

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.034

文章编号：1671- 9646（2016）04b- 0016- 04

收稿日期：2016- 03- 21

基金项目：国家星火计划重点项目（2015GA650007）；辽宁省“百千万人才工程”资助项目（2013921038）；沈阳市科技创新专项资金项目（F14- 104- 3- 00）。

作者简介：王霞（1991—），女，在读硕士，研究方向为生物化工。

*通讯作者：肖志刚（1972—），男，博士，教授，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。