重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响

陈　炜,周克夫,栗　华

(1.福建中医药大学研究生院,福建福州350108；2.厦门大学附属第一医院,福建厦门361005;3.厦门大学环境与生态学院,福建厦门361102)

·研究简报·

重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响

陈炜1,2,周克夫3,栗华2*

(1.福建中医药大学研究生院,福建福州350108；2.厦门大学附属第一医院,福建厦门361005;3.厦门大学环境与生态学院,福建厦门361102)

摘要：为观察不同时期应用重组胸腺素α原(ProTα)药物干预下肝癌荷瘤小鼠的抑瘤率,并研究其对Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响,将36只昆明小鼠随机分成空白组、荷瘤组、药物干预组,H22小鼠肝癌细胞皮下移植建立荷瘤小鼠模型,腹腔注射重组ProTα,观察7和14 d后肝癌荷瘤小鼠的抑瘤率,并检测外周单个核细胞中调节性T细胞(Treg细胞)和NKG2D阳性细胞的比例．结果表明:移植瘤7 d后,药物干预组和荷瘤组瘤质量对比无显著差异；而移植瘤14 d后,药物干预组瘤质量较荷瘤组有显著减小．荷瘤14 d后,荷瘤组较空白组Treg细胞比例升高,NKG2D阳性细胞比例下调,差异显著；而不论是早期药物干预组还是进展期(即移植瘤7 d后)药物干预组,Treg细胞比例均显著降低,NKG2D阳性细胞显著升高．由此可见,重组ProTα能够抑制肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长,且早期、长期用药效果更好,相关作用机制涉及下调Treg细胞数量从而抑制肝癌细胞免疫逃逸,并上调NKG2D阳性细胞数量从而提高其介导的抗肿瘤效应．

关键词：重组胸腺素α原;肝癌;调节性T细胞(Treg细胞);NKG2D

1995年,Sakaguchi等[1]发现回输CD4+CD25+T细胞可以阻止裸鼠自身免疫疾病发生,因此将这一类具有抑制机体免疫功能的细胞命名为调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)．大量研究发现,Treg细胞广泛存在于各种肿瘤微环境中[2-4],并且与肿瘤的预后呈负相关[5]．张蘋等[6]发现肝癌荷瘤小鼠脾脏、引流淋巴结中CD4+CD25+Treg细胞比例较对照组升高,且Treg细胞数量的多少与肿瘤大小呈正相关．NKG2D是自然杀伤(natural killer,NK)细胞的活化受体,除了NK细胞外,NKG2D还表达于活化的CD8+T细胞及γδT细胞．NKG2D与特异性配体结合,发挥免疫应答和免疫监视作用．目前已知的配体主要是组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和UL16结合蛋白(ULBP)家族[7-8]；此外,组织相容性抗原60、视黄酸早期转录因子1也参与NKG2D的免疫调控[9]．NKG2D配体主要在受感染细胞和恶性肿瘤细胞表面表达,健康细胞很少表达．在肿瘤细胞和效应性T细胞表面,Groh等[10]发现NKG2D与可溶性配体MIC结合后发生内化降解,导致效应T细胞抗肿瘤作用减弱．Tomohiro等[11]发现在胃癌患者体内,CD8+T细胞表面NKG2D的表达显著下调,并且NKG2D的表达与癌组织的侵润深度呈负相关．

胸腺素α原(prothymosin α,ProTα)分布于哺乳动物各种组织．内源性的ProTα具有促进细胞增殖的作用,并参与细胞凋亡和肿瘤生长的调控．外源性ProTα具有较好的增强机体免疫和抗肿瘤作用,能够促进白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素(IFN)的分泌,刺激肿瘤特异性T淋巴细胞的产生,发挥抗肿瘤作用[12-14]．我们前期的研究证实[15-16],重组ProTα对于荷瘤及癌性腹水小鼠肿瘤生长和生存周期有较好的改善作用,但其对肝癌荷瘤小鼠Treg细胞和NKG2D表达的影响尚不清楚．本实验通过早期及进展期药物干预,观察重组ProTα对荷瘤小鼠抑瘤率的影响,并研究其对Treg细胞和NKG2D阳性细胞是否具有调节作用．

1材料与方法

1.1材料

实验动物为雄性昆明(KM)小鼠,5～6周,SPF级,共36只,购买于厦门大学实验动物中心．小鼠H22肝癌细胞由厦门大学附属第一医院肿瘤实验室保种．

1.2主要试剂及仪器

重组ProTα[17]、Treg细胞流式染色试剂盒(美国eBioscience公司)、PE-antiCD314抗体(即NKG2D，美国eBioscience公司)、淋巴细胞分离液(天津灏洋有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS,实验室自配)、RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)，流式细胞仪(美国BD公司，型号:LSRFortessaTM)．

1.3实验方法

1.3.1移植瘤小鼠模型的构建

取出H22细胞冻存管,37 ℃恒温水浴锅速融1～2 min,1 000 r/min离心,去上清,无菌PBS洗涤细胞,加入适量RPMI 1640培养基,吸打成悬液,取适量注射入小鼠体腔,饲育1周后脱脊处死.无菌条件下取小鼠腹水,加入适量培养基稀释,1 000 r/min离心,去上清,PBS洗涤,加入适量培养基重悬计数,细胞浓度约1×108mL-1．将36只KM雄性小鼠随机分成3组,分为空白组(normal,N)6只、荷瘤组(tumor,T)12只、药物干预组(drug,D)18只,其中T组和D组每只小鼠右小腿外侧皮下注射0.1 mL细胞悬液,细胞数目约1×107．

1.3.2重组ProTα干预

将上述T组小鼠随机分成2小组(T-7、T-14),各6只,分别于荷瘤7和14 d后脱脊处死；D组小鼠随机分成3小组(D-7、D-14、D进-7),各6只,其中D-7、D-14组小鼠于移植瘤第2天每只每天腹腔注射300 ng重组ProTα[15,17],并于药物干预7和14 d后分别脱脊处死,而D进-7组小鼠于移植瘤后第8天开始每只每天腹腔注射同等剂量药物,干预7 d后处死；N组小鼠每只每天腹腔注射等体积无菌生理盐水,于14 d后处死．

1.3.3计算抑瘤率

无菌条件下剥离小鼠肿瘤,称取小鼠瘤质量(m),计算抑瘤率,比较小鼠肿瘤大小及抑瘤率．

1.3.4流式细胞术检测Treg细胞及NKG2D阳性细胞比例

无菌条件下分离小鼠脾脏,加入适量培养基研磨,200目筛网过滤,PBS洗涤3次,淋巴细胞分离液分离外周单个核淋巴细胞(PBMC),适量PBS重悬细胞,使细胞浓度约1×107mL-1.每个流式上样管中加入100 μL准备好的细胞悬液,细胞数目约1×106,根据Treg细胞流式染色试剂盒及NKG2D流式试剂说明书加入相应膜表面染色抗体,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗涤细胞,另于Treg细胞标记管中加入固定/破膜工作液,避光孵育30 min,PBS洗涤,加入核内标记抗体避光孵育30 min,PBS洗涤细胞后2 000 r/min离心去上清,加入适量PBS重悬细胞,上机检测并分析．

1.3.5统计分析

实验数据用SPSS 18.0软件分析,统计结果用平均值±标准差表示,组间比较采用配对或成组t-检验,p<0.05表示差异显著．

2结果与分析

2.1药物干预的抑瘤效果

T组及D组的肿瘤大小及瘤质量如图1和2所示．药物干预7 d后,D-7组较T-7组的小鼠瘤质量略有减小,计算抑瘤率为30.41%,但差异并不显著(p=0.148 9)；而药物干预14 d后,D-14组较T-14组的小鼠瘤质量显著减小(p=0.003 1),抑瘤率为54.59%．同T-14组小鼠相比,进展期药物干预(D进-7)组也有显著效果(p=0.018 4),抑瘤率为39.15%．

图1　T组与D组的肿瘤大小Fig.1The tumor size of tumor-bearing group and drug intervention group

*p>0.05,**p<0.05，下同.图2　T组与D组的瘤质量Fig.2The tumor mass of tumor-bearing group and drug intervention group

2.2Treg细胞及NKG2D阳性细胞比例变化

图3　CD25+Foxp3+ Treg细胞占CD4+细胞比例Fig.3The proportion of CD25+Foxp3+Treg cells in CD4+ cells

运用流式细胞术检测CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+细胞比例,以及PBMC中NKG2D阳性细胞的比例,结果分别如图3和4所示．与N组小鼠对比,T-7及T-14组小鼠的Treg细胞比例有不同程度的升高(其中N组与T-7组相比p>0.05,而N组与T-14组相比p<0.05),而NKG2D阳性细胞比例均显著降低(p<0.05)．药物干预7 d后,D-7组较T-7组Treg细胞比例略有降低,NKG2D阳性细胞比例略有升高,但差异均不显著(p>0.05)．而与T-14组小鼠相比，D-14组及D进-7组小鼠的Treg细胞比例均显著降低(p<0.05),NKG2D阳性细胞比例显著升高(p<0.05)．

图4　NKG2D阳性细胞占PBMC比例Fig.4The proportion of NKG2D-positive cells in PBMC

3讨论

Treg细胞是促进肿瘤免疫逃逸的重要细胞．Treg细胞通过识别免疫细胞表面的MHC,并经T细胞受体(TCR)介导提呈,抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖．Foxp3是Treg细胞特异的转录因子,Treg细胞可以通过IL-2/STAT、转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路诱导Foxp3表达,促进肿瘤免疫逃逸[18-19]．此外,腺苷/前列腺素E2以及凋亡途径Fas/Fasl也可能参与Treg细胞诱导的促肿瘤免疫逃逸[20-21]．Zhang等[22]发现,利用Foxp3 siRNA转染Treg细胞,通过下调Foxp3表达,能够显著抑制Treg细胞增殖,呈现出明显的抗肿瘤效应．本研究发现,T组小鼠Treg细胞比例较N组小鼠不同程度地升高,并且T-14组小鼠Treg细胞比例较T-7组小鼠升高,瘤质量明显增加,提示Treg细胞参与肝癌细胞免疫逃逸,促进肿瘤生长,这与已有的研究结果是一致的[6]．而应用重组ProTα干预后,小鼠Treg细胞比例降低,并且D-14组小鼠Treg细胞比例较D-7组小鼠进一步降低,抑瘤率明显增大,可见,重组ProTα能够通过抑制Treg细胞增殖,阻止肿瘤生长．

NKG2D/NKG2DL通路在机体的免疫监视中起重要作用．Sha等[23]对比原发性肝癌、乙型肝炎肝硬化、慢性乙型肝炎患者和健康人,发现肝癌患者中NKG2D的表达、NK细胞的活性明显低于其他人群．Jiang 等[24]也发现原发性肝癌组织中NK细胞比例和NKG2D表达均明显低于癌旁组织,并且与肿瘤的临床分期呈负相关．在体内,肿瘤细胞通过多种途径下调NKG2D表达,逃脱免疫监视和免疫清除．Clayton等[25]发现肿瘤细胞产生大量的TGF-β,通过降低NKG2D在CD8+T细胞及NK细胞的表达,减弱NKG2D介导的抗肿瘤效应,而应用TGF-β中和抗体可恢复NKG2D的表达,呈现出显著的抗肿瘤作用．在一项关于卵巢癌的研究中,Mathias等[26]发现不论是体内还是体外实验,巨噬细胞迁移抑制因子通过下调NKG2D表达,可以抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,促进肿瘤细胞的免疫逃逸．本研究中发现,与N组小鼠相比,T组小鼠NKG2D阳性细胞减少．同时我们观察到通过腹腔注射重组ProTα,肝癌小鼠NKG2D阳性细胞比例逐渐升高,且干预时间越长,NKG2D阳性细胞升高越明显,对肿瘤的抑制效果越显著,但重组ProTα上调NKG2D阳性细胞的作用机制尚不清楚．Ghiringhelli等[27]的研究表明,Treg细胞可以通过表达膜表面蛋白TGF-β,抑制NK细胞表面NKG2D的表达,降低NK细胞的杀伤作用,降低机体的抗肿瘤作用．Smyth等[28]将Treg细胞转输至重组激活基因(RAG-1)缺陷的小鼠中,也发现Treg细胞能够抑制NKG2D的表达,降低NK细胞的抗肿瘤活性．本实验中是否存在相似的机制还需要深入研究．

综上所述,本研究通过腹腔注射重组ProTα,观察不同时期重组ProTα干预对移植瘤小鼠抑瘤率的影响,发现不论是肿瘤早期还是进展期进行药物干预,重组ProTα对肿瘤均有一定抑制作用,但早期、较长时间应用重组ProTα能够明显抑制肿瘤生长，对于进一步的临床应用具有指导意义．通过7和14 d取样对比,在一定程度上动态监测了Treg细胞、NKG2D阳性细胞的变化情况，发现腹腔注射重组ProTα 14 d后,D-14组小鼠Treg细胞比例较T-14组明显降低,NKG2D阳性细胞比例上调,抗肿瘤效应增加．以上研究结果提示,重组ProTα可通过下调Treg细胞比例而抑制肝癌细胞免疫逃逸,并上调NKG2D阳性细胞比例而提高NKG2D介导的抗肿瘤效应,具体的信号通路需要后续的课题进一步深入研究．

参考文献：

[1]SAKAGUCHI S,SAKAGUCHI N,ASANO M,et al．Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25)．Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J]．Journal of Immunology,1995,155(7):3808-3821.

[2]HE Y Q,QIAO B,WEI Y,et al．Foxp3 genetic variants and risk of non-small cell lung cancer in the Chinese Han population[J]．Gene,2013,531(2):422-425.

[3]NASROLLAH E,MAHBOOBEH H S,SOMAYEH R,et al．Foxp3+regulatory T cells in peripheral blood of patients with epithelial ovarian cancer[J]．Iranian Journal of Immunology,2014,11(2):105-112.

[4]WINERDAL M E,PER M,MAX W,et al．Foxp3 and survival in urinary bladder cancer[J]．BJU International,2011,108(10):1672-1678.

[5]XU W,LIU H,SONG J,et al．The appearance of Tregs in cancer nest is a promising independent risk factor in colon cancer[J]．Journal of Cancer Research & Clinical Oncology,2013,139(11):1845-1852.

[6]张蘋,张利宁,朱法良,等．肝癌荷瘤小鼠调节性T细胞数量的改变及其与肿瘤生长的关系[J]．中华肿瘤杂志,2008,29(5):342-345.

[7]KONSTANTINA E,TANER S B,ONFEL B,et al．Cell surface organization of stress-inducible proteins ULBP and MICA that stimulate human NK cells and T cells via NKG2D[J]．Journal of Experimental Medicine,2004,199(7):1005-1010.

[8]ANDREAS D,JENNIFER H,MING-YU H,et al．A novel ligand for the NKG2D receptor activates NK cells and macrophages and induces tumor immunity[J]．European Journal of Immunology,2003,33(2):381-391.

[9]DIEFENBACH A,JENSEN E R,JAMIESON A M,et al．Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity[J]．Nature,2001,413(6852):165-171.

[10]GROH V,WU J,YEE C,et al．Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.[J]．Nature,2002,419(6908):734-738.

[11]TOMOHIRO O,HIROAKI S,TOSHIAKI Y,et al．Decreased NKG2D expression on CD8+T cell is involved in immune evasion in patients with gastric cancer[J]．Clinical Cancer Research,2007,13(21):382-387.

[12]EILERS M S,SCHIRM S,BISHOP J M．The MYC protein activates transcription of the α-prothymosin gene[J]．Embo Journal,1991,10(1):133-141.

[13]郑金来．胸腺素α原研究进展[J]．国际免疫学杂志,1998(4):210-214.

[14]王梅,潘吉勇．胸腺素α原与肿瘤关系的研究进展[J]．癌症：英文版,2007,26(3):333-336.

[15]蔡报伟,栗华,韩伟,等．胸腺素原体内抑制小鼠肝癌细胞H22的研究[J]．中国免疫学杂志,2012,28(5):412-414.

[16]韩伟．重组人胸腺素α原抗肿瘤活性及机理研究[D]．厦门：厦门大学,2011:14-25.

[17]周克夫,厦门伯赛基因转录技术有限公司．胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用:中国,CN201210086166.0[P]．2012-07-18[2015-12-16].

[18]ZORN E,NELSON E A,MOHSENI M,et al．IL-2 regulates Foxp3 expression in human CD4+CD25+regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo[J]．Blood,2006,108(5):1571-1579.

[19]MASSAGUE J,GOMIS R R．The logic of TGF-beta signaling．FEBS Lett,2006,580(12):281l-2820.

[20]MAGIS M,WHITESIDE T L．Targeting human inducible regulatory T cells (Tr1) in patients with cancer:blocking of adenosine-prostaglandin E(2) cooperation[J]．Expert Opinion on Biological Therapy,2011,11(9):1203-1214.

[21]STRAUSS L,BERGMANN C T．Human circulating CD4+CD25highFoxp3+regulatory T cells kill autologous CD8+but not CD4+responder cells by Fas-mediated apoptosis[J]．Journal of Immunology,2009,182(3):1469-1480.

[22]ZHANG H H,FEI R,XIE X W,et al．Specific suppression in regulatory T cells by Foxp3 siRNA contributes to enhance the in vitro anti-tumor immune response in hepatocellular carcinoma patients[J]．Journal of Peking University(Health Sciences),2009,41(3):313-318.

[23]SHA W H,ZENG X H,MIN L．The correlation between NK cell and liver function in patients with primary hepatocellular carcinoma.[J]．Gut Liver,2014,8(3):298-305.

[24]JIANG J H,ZHOU Z F,LI J Y,et al．Expression and significance of the NK cell receptors in primary hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues[J]．Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology,2012,28(5):529-532.

[25]CLAYTON A,MITCHELL J P,COURT J,et al．Human tumor-derived exosomes down-modulate NKG2D expression[J]．Journal of Immunology,2008,180(11):7249-7258.

[26]MATHIAS K,YVONNE D,CLAUDIA W,et al．Macrophage migration inhibitory factor contributes to the immune escape of ovarian cancer by down-regulating NKG2D[J]．Journal of Immunology,2008,180(11):7338-7348.

[27]GHIRINGHELLI F,MENARD C,TERME M,et al．CD4+CD25+regulatory T cells inhibit natural killer cell functions in a transforming growth factor-beta-dependent manner[J]．Journal of Experimental Medicine,2005,202(8):1075-1085.

[28]SMYTH M J,TENG M W L,JEREMY S,et al．CD4+CD25+T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer[J]．Journal of Immunology,2006,176(3):1582-1587.

Influence of Proportion of Treg Cells and NKG2D-positive Cells by Recombinant ProTα in Mice Bearing Liver Cancer

CHEN Wei1,2,ZHOU Kefu3,LI Hua2*

(1．Graduate School of Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350108,China;2．The First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen 361005,China;3．College of the Environment & Ecology, Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:To observe the tumor inhibition rate by recombinant ProTα in liver cancer-bearing mice model,and to study the influence of the proportion of Treg cells and NKG2D-positive cells,36 Kunming mice were randomly divided into control group,tumor-bearing group and drug intervention group．Then a tumor-bearing mice model was established by transplanting H22 cells subcutaneously．By medicating recombinant ProTα through intraperitoneal injection,we observed the tumor inhibition rate after 7 days and 14 days,and detected the proportion of Treg cells and NKG2D-positive cells in PBMCs．Results showed that the difference in tumor mass between the tumor-bearing group and the drug intervention group was not significant after bearing tumor for 7 days．However,after bearing tumor for 14 days,the difference in tumor mass was significant．Additionally,the proportion of Treg cells increased and the number of NKG2D-positive cells declined significantly in the tumor-bearing group after bearing tumor for 14 days．No matter 14 days intraperitoneal injection of recombinant ProTα or drug intervention from the advanced stage,the proportion of Treg cells declined and the number of NKG2D-positive cells increased significantly．The results suggest that recombinant ProTα inhibits tumor growing,and the early and long-term drug intervention benefits the most．It is believed that the putative mechanism is related to that recombinant ProTα down-regulates the proportion of Treg cells,inhibiting the immune escape of hepatocellular carcinoma cells,and up-regulates the number of NKG2D-positive cells,improving the NKG2D-mediated anti-tumor effect.

Key words:recombinant ProTα;liver cancer;regulatory T cell (Treg cells);NKG2D

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.026

收稿日期：2015-12-16录用日期：2016-02-16

基金项目：福建省自然科学基金(2013J01383)；福建省医学创新课题(2009-CXB-51)

*通信作者：endohlihua@126.com

中图分类号:R 735.7

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)03-0456-05

引文格式：陈炜,周克夫,栗华.重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响.厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(3)：456-460.

Citation：CHEN Wei,ZHOU Kefu,LI Hua．Influence of proportion of Treg cells and NKG2D-positive cells by recombinant ProTα in mice bearing liver cancer.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：456-460．(in Chinese)