金针菇凝集素基因Fv-mJRL1的生物信息学分析及其共表达

陈仁良,王　威,严俊杰,熊宏民,谢宝贵

(福建农林大学生命科学学院菌物研究中心,福建福州350002)

金针菇凝集素基因Fv-mJRL1的生物信息学分析及其共表达

陈仁良,王威,严俊杰,熊宏民,谢宝贵*

(福建农林大学生命科学学院菌物研究中心,福建福州350002)

摘要：Jacalin凝集素(jacalin-related lectins,JRLs)是一类含有一个或多个JRL结构域的蛋白质,参与生物或非生物环境刺激应答．本研究基于金针菇(Flammulina velutipes)基因组数据,注释筛选到其中一个JRL基因Fv-mJRL1,对其基因结构、蛋白质性质进行了生物信息学分析,并利用其上游调控序列进一步预测到该基因潜在的转录因子Fv-Mbp1．通过实时荧光定量PCR分析得知,无论是在不同栽培基质培养的金针菇菌丝还是在金针菇各发育时期的组织中,Fv-mJRL1基因与潜在的转录因子基因Fv-Mbp1之间都存在极强的共表达规律．生物信息学及实时荧光定量PCR分析为筛选挖掘基因潜在的转录因子提供便利,后期仍需利用下游分子实验进行更为精确的验证．

关键词：jacalin凝集素;子实体形成;潜在转录因子;皮尔森相关系数

金针菇营养丰富且味道鲜美,具有很高的食用和药用价值,是我国和东南亚地区重要的商业性栽培食用菌．金针菇属低温结实性食用菌,菌丝生长适宜温度为20～23 ℃,原基形成适宜温度为3～18 ℃[1]．菌丝营养生长结束之后,需要低温处理刺激原基形成,但这种低温刺激影响金针菇结实的分子机理尚不清楚．Jacalin凝集素(jacalin-related lectins,JRLs)作为植物凝集素超家族中新发现的家族,是能够与植物来源的糖类化合物结合的非经典凝集素,根据糖基结合特异性,JRLs分为与半乳糖特异结合的jacalin凝集素(galactose specific jacalin-related lectins,gJRLs)[2]和与甘露糖或葡萄糖特异结合的jacalin凝集素(mannose specific jacalin-related lectins,mJRLs)[3]．在植物中非经典凝集素能响应胁迫刺激并参与细胞调控与信号转导[4],均表明此类凝集素与体内糖类化合物结合,作为参与植物自身信号传导的内源性凝集素．大多数JRL基因具有响应生物或非生物胁迫刺激的功能,与经典凝集素在功能上有着明显区别[5],因此对于金针菇中JRL基因的研究,有助于揭示低温刺激影响金针菇结实的分子机理．

真菌凝集素与自身的生长发育息息相关,经研究发现：灰树花(Grifolafrondosa)Gf-mJRL在子实体中活性最高,而在菌丝及原基中活性较低[6]；密褐褶孔菌(Gloeophyllumtrabeum)Gt-mJRL与其木质素降解酶系进化有一定的相关性[7]；红菇蜡伞(Hygrophorusrussula)Hr-mJRL的N-和O-糖苷结合形式及有无信号肽等的研究进一步拓展了分子理论研究[8].但目前对于真菌JRLs在分子表达调控领域的研究尚少．我们分析金针菇不同生长发育阶段的转录组数据,发现金针菇内源凝集素基因Fv-mJRL1表达量在原基期最高．生物信息学分析显示其基因上游调控序列存在多个顺式作用元件，且存在多个磷酸化、糖基化和豆蔻酰化等蛋白功能修饰位点，是蛋白功能趋近于植物且聚类为担子菌的亲水性内源凝集素.结合出菇实验及葡萄糖、稻草、木屑等常用出菇栽培基质诱导实验,探索Fv-mJRL1对金针菇原基形成的影响,并挖掘其潜在的转录调控因子,将有助于阐明金针菇子实体形成的分子调控机理．

1材料与方法

1.1材料

金针菇异核体菌株 H1123由单核菌株W23和L11配对获得．W23菌株的基因组数据和H1123菌株各发育时期的转录组数据均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供,其中W23菌株的基因组数据已提交至DDBJ/EMBL/GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),登录号为APHZ00000000(BioProject:191864)．

1.2Fv-mJRL1基因鉴定以及生物信息学分析

通过金针菇H1123菌株的转录组数据筛选,结合W23菌株全基因组测序的注释数据,获得目的基因Fv-mJRL的DNA序列以及全长编码框序列(CDS)．在NCBI进行BLAST比对发现Fv-mJRL与Gf-mJRL具有较高同源性,本菌株共注释到3个mJRL基因,故将目的基因命名为Fv-mJRL1．

采用SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白质信号肽预测与分析;采用TargetP程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对蛋白质亚细胞进行定位分析;采用Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白质二级结构和三级结构;利用ExPASy(http:∥web.expasy.org/)对蛋白疏水性及豆蔻酰化位点进行预测;采用在线软件NetPhos 2.0 Servier(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点．利用 ClustalX 的Muscle比对方法进行同源比对,参数为默认值；以同源比对数据为基础,采用MEGA 5.0 软件包(参数为 bootstrap values 1 000 resamplings)构建相应序列的邻接法(neighbor-joining)系统进化树．

1.3Fv-mJRL1基因上游调控转录因子预测

参照陈仁良等的方法[9],从金针菇W23菌株基因组注释数据获取Fv-mJRL1基因的上游调控序列,采用Promoter 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)分析基因启动子在上游调控序列中的分布情况,进一步采用转录因子检索数据库YEASTRACT(http:∥www.yeastract.com/)预测启动子潜在结合的转录因子,通过酵母基因组数据库SDG(http:∥www.yeastgenome.org/)及真菌转录因子数据库FTFD(http:∥ftfd.snu.ac.kr/)与本实验室金针菇蛋白质组数据库进行比对获取金针菇同源转录因子[10]．

1.4金针菇菌株的培养

基础培养基的配方如下(g/L):KH2PO41.0,K2HPO40.4,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2·2H2O 0.013,酵母提取物0.5,L-天冬酰胺1.5,NH4NO30.5,盐酸硫胺0.03 (过滤除菌)；另Tween80 2 mL,微量元素溶液1 mL,并用0.1 mol/L的KOH溶液调节pH到6.5．其中微量元素溶液的配方(g/L):FeC6H5O74.8,CoCl2·6H2O 0.4,ZnSO4·7H2O 2.64,MnCl2·4H2O 2.0,CuSO4·5H2O 0.4．

利用葡萄糖、稻草(WJY116,100目过筛)和木屑(湖桑,100目过筛)3种常用的栽培基质,分别按1 g/mL加入基础培养基诱导培养．以添加葡萄糖的基础培养基作为对照,置于摇床中23 ℃、150 r/min培养10 d,收集菌丝．通过搔菌法[1]栽培金针菇菌株H1123,出菇时于栽培料面采集菌丝、菌丝扭结、菌皮、原基(初期、中期、后期)、伸长期和成熟期子实体,以菌丝作为对照．采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit(R6827-01,Bio-Tek公司,美国)分别提取以上材料的总RNA,使用反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司,北京)合成cDNA．

1.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测及基因共表达分析

使用软件Premier 5.0 进行qRT-PCR引物设计,并选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)作为内参基因[11],引物(表1)由上海生物工程有限公司合成．采用TransStart TOP Green qPCR试剂盒(Bio-Rad公司，美国),反应体系及程序按照试剂盒的使用说明书,采用两步法，退火温度为59 ℃,循环数为40,每个反应设置3个重复,相对表达量采用2-ΔΔCT法计算处理[12]．

表1　实时荧光定量PCR所使用的引物

皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)作为基因共表达关系的衡量指标：0.8～1.0为极强相关,0.6～0.8为强相关,0.4～0.6为中等程度相关,0.2～0.4为弱相关,0～0.2为极弱相关或无相关[13]．

2结果

2.1Fv-mJRL1基因的结构及其蛋白质磷酸化位点分析

从W23基因组注释得到Fv-mJRL1基因全长1 126 bp,包括开放阅读框(ORF)775 bp，上游的5′非编码区(5′-UTR)245 bp和下游的3′-UTR 106 bp．以该基因序列作为参照,利用Zoomlite软件将转录组原始序列标签(reads)定位到参考序列上,检测到Fv-mJRL1基因含有4个内含子和5个外显子(E1～E5),编码180个氨基酸,其蛋白质含有1个典型的jacalin-like lectin结构域,InterproScan5预测其属于mJRL,Netphos预测其磷酸化位点可受8类激酶磷酸化(图1)．

IKK，ATM，PKG为丝氨酸激酶;EGFR，INSR，Syk为酪氨酸激酶;PKC，PKA为苏氨酸激酶.图1　Fv-mJRL1基因结构及其表达蛋白的结构域和磷酸化位点分析Fig.1Fv-mJRL1 gene structure analysis and the domain and phosphorylation sites analyses of its expressed protein

2.2Fv-mJRL1蛋白质结构及其疏水性、豆蔻酰化分析

通过在线预测分析显示Fv-mJRL1不含有信号肽(C、S、Y、D各指标值分别为0.299，0.287，0.283，0.285),无跨膜结构,定位在细胞内(细胞质或细胞核),不属于分泌蛋白．ExPASy预测显示Fv-mJRL1存在4个豆蔻酰化位点：G62IQPTY、G140TSFGT、G147QVIAL、G154TDENS(图2(a));其二级结构以β折叠为主,仅含有4个α螺旋;亲水性较好的β3、β4、β7,可利于亚基单体聚合成多聚体后形成亲水性的溶剂通道(图2(b),2(c));Phyre2预测其三级结构(模板为c1x1vB,可信度为98.1%)为由β折叠片层结构组

成对称形棱柱的主体结构,这一空间袋形构型有助于糖基的结合,结合糖基化位点预测BL1(S90)、BL2(S135)和BL3(S159)(图2(c))．

2.3Fv-mJRL1系统进化分析

通过NCBI、EBI数据库选择下载功能已明确的具有代表性的mJRLs蛋白序列进行蛋白功能进化分析,包括：豆(Parkiaplatycephala)P83304、菊芋(Helianthustuberosus)1C3K、田旋花(Convolvulusarvensis)Q9FVA0 、榴莲蜜(Artocarpusinteger)Q7M1T4、红菇蜡伞BAL02996.1、密褐褶孔菌XP_007867984.1、灰树花BAE43874.1、扩展青霉(Penicilliumexpansum)KGO62150.1、稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)KDB12616.1、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)XP_006672990.1．

(a)中三角形为豆蔻酰基化位点；(c)中箭头所示为BL颈环(BL neck rings).图2　Fv-mJRL1蛋白质二级结构(a)、疏水性(b)及豆蔻酰化位点(c)分析Fig.2Analyses of Fv-mJRL1 protein structure (a),hydrophobicity (b) and myristoylation sites (c)

图3　Fv-mJRL1系统进化分析Fig.3The phylogenic analysis of Fv-mJRL1

采用蛋白水平Muscle比对方法构建系统进化树,对蛋白功能进化聚类分析的结果(图3)显示：Fv-mJRL1与其他3个担子菌(Basidiomycete)已知的mJRLs序列同源性较高，聚为同一分支,有别于植物(Plant)和子囊菌(Ascomycotina)．mJRLs同时存在于植物、担子菌和子囊菌,且各自聚类为一类别分支,这表明mJRLs早于植物、担子菌和子囊菌的分化就已经存在;植物与担子菌的亲缘关系相较于子囊菌与担子菌的亲缘关系远,但其mJRLs进化关系相对较近．这意味着亲缘关系较远的植物和担子菌间,其mJRLs进化存在由于生存环境、方式相似而在长期适应过程中所形成的蛋白功能相近的趋同进化现象;而亲缘关系较近的子囊菌和担子菌间,其mJRLs进化关系相对较远,则预示着子囊菌与担子菌由共同的真菌祖先在适应于不同的生存环境、方式过程中，其mJRLs可能向着蛋白功能相互有别的方向发展而趋异进化．

2.4Fv-mJRL1基因及其潜在转录调控因子的共表达分析

W23基因组注释获取Fv-mJRL1基因上游调控序列为964 bp,通过裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的YEASTRACT数据库在线预测分析结果显示,上游调控序列启动子中共存在22类顺式作用元件,其中可结合APSES类型[14]转录因子(Mbp1)的顺式作用元件共3个．我们获取酵母Mbp1的蛋白序列与金针菇蛋白质组进行同源比对,所获取金针菇中的同源蛋白在真菌转录因子库再次进行同源搜索验证后,将其命名为Fv-Mbp1．

qRT-PCR结果(图4(a))显示：以葡萄糖培养条件为对照,在基础培养基分别添加稻草和木屑进行培养,稻草培养的条件下其表达量仅略高于木屑培养条件,可能由于稻草和木屑中含有大量成分不清晰的木质纤维素造成比较结果相对不明晰,但均明显高于表达量甚低的葡萄糖培养条件,在葡萄糖、稻草及木屑液体培养菌丝生长过程表达相关系数为0.956(极强相关)．同时,以未扭结菌丝作为对照,在出菇实验中该基因在菌丝扭结时期的表达量显著高于未扭结菌丝、菌皮、子实体原基(初期、中期、后期)、伸长期和成熟期子实体等阶段(图4(b)),是菌丝期(未扭结)的62.3倍,在正常出菇生长发育过程中表达相关系数为0.968(极强相关)．本研究还揭示了转录因子基因Fv-Mbp1与Fv-mJRL1基因具有紧密的共表达规律,它们在不同条件下的共表达模式,均进一步支持Fv-Mbp1与Fv-mJRL1存在转录调控关系．

(a)不同培养条件：GL.葡萄糖；RS.稻草；SD.木屑.(b)不同发育阶段：myc.菌丝期；knot.扭结；myd.菌皮；pre-pri.原基初期;pri.原基中期；late-pri.原基后期；eln.伸长期；mat.成熟期.图4　Fv-mJRL1基因及其转录因子基因Fv-Mbp1表达变化Fig.4The expression changes of Fv-mJRL1 and its transcription factor gene Fv-Mbp1

3讨论

金针菇凝集素Fv-mJRL1基因的生物信息学分析显示,其上游序列存在较多顺式作用元件,表明其表达可受众多转录因子调控．Fv-mJRL1蛋白结构域中散布着部分保守的氨基酸残基,共38个非极性氨基酸，占结构域氨基酸组成的41.8%,对凝集素肽链折叠和聚合所发挥的生物学作用起关键作用,它的合成受到生物或非生物胁迫刺激的诱导表达[14-15]．同时,Fv-mJRL1蛋白存在着众多功能修饰位点,鉴于其基本理化性质预测分析,与胞内糖基的结合在其功能鉴定中显得尤为重要,其中颈环位点BL1、BL2决定着其糖基结合的特异性,BL3具有较强的保守性但不能决定糖基的特异性[16]．所预测存在的磷酸化位点为Fv-mJRL1激酶信号通路研究提供了参考,但刘芳等[17]研究发现AGC/PKA 苏氨酸蛋白激酶的基因只在金针菇菌丝生长中特异表达而原基时期并不表达,表明Fv-mJRL1基因在原基形成时期表达并不受AGC/PKA 激酶信号通路影响．此外,Fv-mJRL1存在4个豆蔻酰化位点,豆蔻酰化作用可以促进蛋白质-膜间和蛋白质-蛋白质间相互作用[18],但是豆蔻酰化位点的甘氨酸点突变可引起蛋白功能、定位及信号转导发生异常[19],这对于后期研究Fv-mJRL1的功能靶向研究有着指导性意义．

目前,对于mJRLs的研究主要集中探索胁迫诱导型mJRLs的功能及其作用的分子机制[20]、参与生物体内O-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)和N-糖基等内源糖基互作翻译后修饰的功能[21]、参与细胞信号转导的分子机制[22-23],从而用于育种改良．本研究中Fv-mJRL蛋白的系统发育聚类分析结果显示,子囊菌与担子菌间mJRL趋异进化而植物与担子菌间mJRL趋同进化,预示着Fv-mJRL蛋白功能方面可能与植物mJRL较为趋近,与植物的细胞功能、生长发育关系更为密切,而与子囊菌mJRL在生存方式所发挥的功能有一定的差异．

根据本研究实验结果,通过Fv-mJRL1基因及其潜在的APESE型转录因子基因Fv-Mbp1的共表达分析,两者存在着较强的共表达关系，表明Fv-Mbp1作为Fv-mJRL1基因潜在的转录因子的可能性很大．内源甘露糖结合型凝集素Fv-mJRL1基因可能在金针菇子实体原基形成及生长发育过程中作为胞内信号转导的重要组成部分,对菌丝扭结和原基形成阶段具有重要作用．据Doedt等[24]报道APSES型转录因子不仅参与形态的变化,也强烈影响代谢基因的表达,例如诱导糖酵解相关基因的表达,并抑制氧化代谢相关基因的表达,这也进一步佐证在葡萄糖、稻草、木屑基质中Fv-Mbp1潜在调控着Fv-mJRL1基因表达,并可能参与稻草和木屑的降解．在小麦中,mJRL凝集素(VER2)在春化作用中能够通过自身的磷酸化与去磷酸化反应参与O-GlcNAc信号途径[23-24];冷激及机械等非生物胁迫作为金针菇出菇的一般方法,结合生物信息学分析,我们推测定位于细胞质或细胞核的Fv-mJRL1可能存在与小麦凝集素VER2类似的分子作用机制.当金针菇菌丝生长受到外界胁迫刺激时,信号受体将接收不同的外界信号,可由相应的通路激酶激活潜在的转录因子Fv-Mbp1,启动Fv-mJRL1基因的转录和翻译,通过与甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺或其糖蛋白互作,进而影响金针菇菌丝扭结及原基形成的生物学过程．当然,后期仍需下游分子实验(如凝胶阻滞迁移和pull-down等)对所筛选潜在的转录因子进行验证,进一步建立基因或蛋白的调控网络．

食用菌的遗传转化率低在一定程度上牵制着其分子生物学研究的水平,组学和生物信息学结合可为食用菌基础理论研究提供便利．对于食用菌子实体形成与发育的分子调控机制的研究,可借助组学数据迅速筛选目的基因及共表达分析发掘潜在的调控基因表达的“分子开关”(转录因子),初步获得基因时空特异性表达调控变化规律．

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Bioinformatic Analysis and Co-expression Study of Jacalin-related Lectin Gene Fv-mJRL1 in Flammulina velutipes

CHEN Renliang,WANG Wei,YAN Junjie,XIONG Hongmin,XIE Baogui*

(Mycological Research Center,College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Jacalin-related lectins (JRLs) are a subgroup of proteins with one or more jacalin-like lectin domains,and they participate in biological or non-biological response to environmental stimuli．The Flammulina velutipes genomic data were used to screen one lectin gene Fv-mJRL1,and the gene structure and protein properties of biological information were analyzed．The potential transcription factor Fv-Mbp1 was further predicted using its upstream regulatory sequence．Fluorescence quantitative RT-PCR analysis showed that Fv-mJRL1 and the transcription factor gene Fv-Mbp1 were strongly co-expressed,whatever growth in different substances of F. velutipes mycelium or in the various growth developmental stages． Results demonstrated that bioinformatics and qRT-PCR analysis were suitable for the screening of potential transcription factors,however,it is still necessary to use further downstream molecular experiments to verify the data.

Key words:jacalin-related lectin(JRL);sporophore formation;potential transcription factor;Pearson correlation coefficient

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.004

收稿日期：2015-09-14录用日期：2015-12-28

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(2014CB138302)

*通信作者：mrcfafu@163.com

中图分类号:Q 933

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)03-0323-07

引文格式：陈仁良,王威,严俊杰，等.金针菇凝集素基因Fv-mJRL1的生物信息学分析及其共表达.厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(3)：323-329.

Citation：CHEN R L,WANG W,YAN J J,et al．Bioinformatic analysis and co-expression study of jacalin-related lectin geneFv-mJRL1 inFlammulinavelutipes.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：323-329．(in Chinese)