胞二磷胆碱对大鼠弥漫性轴索损伤后神经元保护作用的研究

杨 帆，邓 璐

(泸州医学院附属医院急诊科，四川 泸州 646000)

胞二磷胆碱对大鼠弥漫性轴索损伤后神经元保护作用的研究

杨 帆，邓 璐

(泸州医学院附属医院急诊科，四川 泸州 646000)

目的 探讨胞二磷胆碱对大鼠弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)后脑细胞功能变化的影响，评估药物的治疗价值。方法 采用大鼠头部瞬间旋转损伤装置制备DAI模型，通过胞二磷胆碱及神经元凋亡通路抑制剂辛伐他汀干预控制，对比观察胞二磷胆碱对DAI大鼠神经修复的作用，于术后24、48、72 h及7d提取脑组织标本，western blot法检测SDF-1和神经元凋亡及死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)的表达变化，并检测β-APP的表达来指示轴突的损伤程度，用免疫荧光染色指示RhOA和NOGO-A表达的相关性。结果 DAI模型组24 h后均出现明显的神经细胞坏死和轴突变性等病理改变；大脑皮层RhOA、NOGO-A、SDF-1和DAPK1随着DAI后时间的延长而增加，经免疫荧光双染色显示两者在脑内的表达有显著的同一性；胞二磷胆碱及辛伐他汀能明显降低SDF-1和DAPK1的表达，胞二磷胆碱作用更加显著。结论 胞二磷胆碱可明显改善DAI后神经功能并减轻轴突损伤。

弥漫性轴索损伤；胞二磷胆碱；RhOA；神经元凋亡及死亡相关蛋白激酶1；神经保护；颅脑损伤

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)常见于交通事故，主要由于脑组织在颅脑旋转加速度和/或角加速度所产生的内部剪力作用下，发生广泛白质变性，微小出血，神经轴索回缩等，常与其他颅脑损伤合并，死亡率高。典型表现为长时间意识障碍，临床诊断较困难且预后差，因此，对于DAI治疗的研究有重要意义。目前，已在动物模型、临床患者中证实急性颅脑创伤后存在神经元凋亡[1]以及损伤部位抑制性环境的存在和促进性环境的缺失[2]，同时，各种炎症因子所介导的炎症反应在DAI发病机制中也发挥着重要作用[3]。本研究旨在采用胞二磷胆碱(cytidine diphosphate choline，CDPC)干预大鼠，并通过头颅瞬间机械旋转损伤制作大鼠DAI模型[4]，通过免疫组化、western blot等方法测定DAI后药物干预组与对照组脑组织中轴突生长抑制因子RhOA、勿动蛋白(NOGO-A)、炎症因子:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、神经元凋亡标志物:淀粉样肽前体蛋白抗体(amyloid precursor protein，β-APP)和神经元凋亡及死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)的表达变化，评估胞CDPC在弥漫性轴索损伤后对神经元的保护作用以及促进轴突功能恢复的价值，为临床治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 成年雄性SD大鼠，购自四川医科大学实验动物中心，共60只，体重(290±18)g。CDPC注射液(四川梓橦宫药业)，辛伐他汀(四川梓橦宫药业)，RhOA单抗(abcom，英国)，NOGO-A多抗(abcom，英国)，β-APP单抗(sigma，美国)，SDF-1单抗(sigma，美国)，DAPK1单抗(GenTex，美国)。

1.2 DAI模型制作及分组 采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制作DAI模型。方法:大鼠经100 g/L水合氯醛2.0 ml/kg浅麻醉后俯卧位头部固定在装置的旋转平台，调整躯干与平台间夹角约30°，按动扳机，使其头颅瞬间旋转90°，遇到阻挡后随即又瞬间停止，重复打击8次。大鼠根据干预不同分为正常组、对照组和辛伐他汀组各10只，CDPC组30只。正常组为未损伤正常大鼠，对照组DAI造模后不加干预处理，辛伐他汀组在DAI前每日用辛伐他汀(60 mg/kg)连续灌胃1周，CDPC组在DAI前用CDPC注射液颅内注射(100 mg/kg)。术后辛伐他汀组每日用辛伐他汀灌胃(100 mg/kg)，CDPC组按每日颅内注射剂量分为100 mg/kg组、150 mg/kg组和200 mg/kg组各10只，分别于DAI术后24、48、72 h收集脑组织标本备检。

1.3 western blot 检测 取脑后，匀浆化，用RIPA提取总蛋白，蛋白-80 ℃保存。每孔取40 μg蛋白样品，用SDSPAG凝胶电泳后转膜至PVDF膜，脱脂牛奶封闭2 h分别加一抗β-APP(1∶500)，SDF-1(1∶1000)和DAPK1(1∶1000)，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后滴加相应的标记二抗(1∶2000)，室温孵育1 h化学发光法观察显影。

1.4 免疫荧光染色 脑组织标本依次经固定、漂洗、脱水并透明后石蜡包埋。每个标本连续切5 μm厚脑切片，切片脱蜡水化后，微波加热修复抗原；山羊血清室温封闭30 min，分别滴加一抗RhOA(1:100)，NOGO-A(1:100)，避光孵育1 h后，加入对应二抗，DAPI 液封片；荧光显微镜下观察、分析、采集图像。

2 结果

2.1 CDPC抑制DAI后轴突生长抑制因子的生成

DAI造模后48 h，对照组中SDF-1、DAPK1表达量较正常组升高，说明DAI造模成功。每日用CDPC治疗剂量(100 mg/kg)干预48 h后明显抑制SDF-1、DAPK1的表达，辛伐他汀干预7 d后SDF-1表达水平也有较明显的下降(图1，图2)。DAI术后每日分别用100、150和200 mg/kg剂量的CDPC干预大鼠，7 d后提取各自脑组织标本，结果发现β-APP含量随药物浓度升高出现梯度下降(图3)。

2.2 RhOA/NOGO-A免疫荧光染色 选择7 d后对照组和CDPC组脑组织作RhOA、NOGO-A免疫荧光双染色，结果发现两种蛋白在轴索损伤部位表达有高度相关性，经CDPC干预后抑制因子RhOA、NOGO-A较对照组明显降低(图4)。

图1 SDF-1在各组脑组织中的表达情况

图2 DAPK1在各组脑组织中的表达情况

图3 不同CDPC浓度干预7d后β-APP在各组脑组织中的表达情况

图4 RhOA/NOGO-A免疫荧光双染色(×400)

3 讨论

CDPC又名胞嘧啶核苷二磷酸胆碱，是脑代谢激活剂，能够保护神经元及神经髓鞘参与受损中枢神经的修复和再生，促进脑细胞呼吸，改善脑功能[5]。近年来有研究报道中性粒细胞浸润在弥漫性轴索损伤中发挥着重要作用[6]。因此，探索DAI后药物治疗与外周炎症细胞浸润的相互联系具有重要意义，本实验中CDPC显著抑制DAI后损伤部位炎症趋化因子的生成，从而有效抑制炎症反应对局部脑组织损伤，对照组大鼠DAI后48 h脑组织中SDF-1表达明显升高，但通过CDPC干预其含量显著降低，表明CDPC能有效控制损伤脑组织炎症浸润因子的生成，辛伐他汀干预效果不如CDPC明显。同样的效应机制也体现在DAPK1检测结果中，DAPK1可通过多种途径介导神经细胞的死亡，与对照组和辛伐他汀组比较，CDPC对DAPK1分泌表现出很强抑制作用。β-APP由β淀粉样前体蛋白水解而来，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用，与神经元的变性和凋亡关系密切[7]。我们分别用三种不同剂量CDPC干预大鼠，检测β-APP，发现7d后β-APP含量随药物浓度升高出现梯度下降。研究发现，RhOA是轴突生长的抑制因子，在DAI发病机制中发挥着重要作用[8]，我们通过荧光双染色检测RhOA与其下游蛋白NOGO-A表达的空间位置关系，结果显示两种蛋白在轴索损伤部位表达有高度相关性，经CDPC干预后RhOA、NOGO-A较对照组明显降低。

综上所述，神经细胞功能激活剂CDPC在大鼠弥漫性轴索损伤后可以有效保护神经元功能，调控炎症因子及神经细胞抑制因子生成，有利于受损中枢神经的修复和再生，改善脑功能。

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The effect of cytidine diphosphate choline on neuroprotection following diffuse axonal injury in rats

YANG fan，DENG Lu

(Department of Emergency medicine，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)

DENGLu

Objective To investigate the effect of cytidine diphosphate cholineon neuroprotection following diffuse axonal injuryso as to evaluate the therapeutic effect. Methods The DAI model was prepared by using a coronal rotation device，and the brain tissue was obtained at 24 h，48 h and 72 h after DAI. The effect of neuroprotection of cytidine diphosphate and neuronal apoptosissignaling pathway inhibitor simvastatin was observed contrastively，The expression of SDF-1 and DAPK1 was detected by western blot，and the expression of β-APP as an indicater for the severity of axonal injury. The immunofluorescence double staining was used to observe the correlation of NOGO-A and RhOA expression.Results There were pathologic changes in the rats at 24 h after DAI such as neuronal death and axonal disruption.The expression of RhOA，SDF-1，NOGO-A and DAPK1 were in the consistent trend in that all of them increased with prolonged time duration and were significantly increased in cerebral cortex at 24 h，48 h，72 h and 7d after DAI compared with that in the control group.The expression of β-APP was also significantly increased at 24 h，48 h，72 h and 7d after DAI compared with that in the control group.On the contrary，after the administration of cytidine diphosphate choline and simvastatin，the level of RhOA，SDF-1，NOGO-A and DAPK1were also markedly decreased in the cytidine diphosphate choline and simvastatin group compared with those in DAI group，further more the cytidine diphosphate cholinegroup has a more obvious suppression.Conclusion The cytidine diphosphate choline can significantly improve the neurological function and repress the axonaldisruptionafter DAI.

Diffuse axonal injury；Cytidine diphosphate choline；RhOA；DAPK1；Neuroprotection；Traumaticbraininjury

R651.1；R917

A

1672-6170(2016)02-0063-03

2015-09-01；

2015-12-24)