血管表皮生长因子对大肠癌细胞生长的影响机制研究

王　益　张　晶　刘　蓓

430064 武汉科技大学附属天佑医院



血管表皮生长因子对大肠癌细胞生长的影响机制研究

王益张晶刘蓓

430064 武汉科技大学附属天佑医院

【摘要】目的探讨VEGF对大肠癌细胞生长的影响机制研究。方法采用基因芯片方法，筛选大肠癌的相关因子。采用免疫组化方法检测大肠癌组织、癌旁组织和正常组织中VEGF的表达。采用免疫荧光方法检测三种组织内淋巴管和血管中VEGF的 表达。结果基因芯片筛选结果显示VEGF在大肠癌组织中呈高表达。免疫组化结果显示22例大肠癌组织中VEGF呈高表达，与正常组织比较，具有统计学意义，P<0.05。免疫荧光检测结果显示在癌组织中呈高表达VEGF时其淋巴管和血管内均增高(相比于正常组时)，且有统计学差异，(分别为P<0.001和P<0.05)，在癌旁组织中VEGF呈低表达(相比于癌组织)时相对癌组织，淋巴管和血管内均降低，且有统计学差异(分别为P<0.001和P<0.05)。结论VEGF可以通过调节淋巴内皮细胞进行促进大肠癌细胞的生长。

【关键词】血管表皮生长因子；肠癌；淋巴管

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:737～739)

在西方国家中，结肠癌在肿瘤疾病中处于第二难治愈肿瘤。结直肠癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中上升至第三位，我国和全世界范围的发病率和死亡率仍处于上升趋势[1]。尽管预防措施和治疗手段不断改进，但转移患者5年的生存率低于10%[2-3]，及时控制肿瘤的发生发展和抑制转移是提高生存率的有效手段。它的扩散有很多方式，淋巴管的浸润和转移是其最为常见的方式[4-5]。

表皮生长因子刺激增殖，促进淋巴管的生成和血管新生。据研究表明，VEGF在肿瘤组织中的表达和淋巴结的转移呈正相关，早期的研究表明VEGF家族和其受体在肠癌中会引起肠癌细胞的浸润，而且有人证实VEGF的高表达是促进了其肿瘤相关的淋巴管扩张，因此在肠癌转移抑制淋巴管的生成中成为一个很有效的方式[6]。所以我们需要证实在肠癌中是否VEGF会引起淋巴管和血管的变化，进而引起肠道肿瘤的变化，因此我们对此展开研究。

1材料与方法

1.1临床资料

收集我院普外科大肠癌患者样本22例，男性13例，女性9例，年龄35～78岁，平均(55.3±9.8)岁，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌4例。分别取肿瘤组织相对应的癌旁组织和正常组织作为对照，检测VEGF的表达水平。

1.2方法

1.2.1RT-PCR试剂及方法逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，称取等量组织或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃离心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，静置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃离心15 min，离完后分为3层，取最上层(中间一层为蛋白)至一新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，颠倒数次混匀；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，弃上清液，小心吸尽液体(此时可以看到白色沉淀即为RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。采用(Ambion公司)小分子分离试剂盒分理处小分子RNA，基因芯片购自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.2免疫组化[7]①脱蜡：按照常规脱蜡方法，在二甲苯，无水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80乙醇脱蜡，大约每次时间为10 min。② 抗原修复：PBS洗后，加入3%H2O2，37 ℃浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，PBS洗，再加入柠檬酸缓冲液，高温高压修复5 min，冷却至室温。③ 血清封闭： PBS洗，5 min，洗3次，擦干组织周围的PBS液，然后10%BSA封闭，放入37 ℃温箱中1小时。④ 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，加完一抗(VEGF，购自于santa)后于4 ℃冰箱中保存过夜。⑤ 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37 ℃温箱中1 h。⑥ 加显色剂：将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上DAB显色剂。

1.2.3免疫荧光染色组织经过固定后，蔗糖梯度脱水，冰冻切片，切片厚度为6 μm，高温修复5 min，待其冷却后，PBS洗涤(3次，每次5 min)，10%BSA封闭50 min，然后进行一抗染色，过夜，第二天复温40 min，PBS洗涤(3次，每次5 min)，然后进行荧光二抗染色，一抗为VEGF(抗兔)，购自于santa，1∶100，标记血管内皮细胞，LYVE-1(抗羊)，购自于santa1∶100，二抗分别选用，抗兔(595 nm)，抗山羊(488 nm)。

1.3统计学处理

应用SPSS 11.0统计软件包处理，统计学方法采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1血管表皮生长因子在大肠癌组织中呈高表达

研究发现所提取的RNA纯度较高，且未出现降解等情况。采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖体RNA)的两个主要亚基，在体内含量较多。28 s/18 s即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28 s/18 s为1.8～2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。电泳条带上应是28 s在上，18 s在下，且亮度为28 s是18 s的两倍，见图1。将正常组织和大肠癌组织进行基因芯片的筛选，在筛选中我们发现VEGF在大肠癌组织中呈高表达，见图2。

图1　电泳图

图2　基因芯片筛选出VEGF在大肠癌组织中的表达

2.2大肠癌组织和正常组织中VEGF的表达(图3)

结果发现，22例大肠癌组织中VEGF呈高表达，与正常组织比较，具有统计学意义，P<0.05。

图3　大肠癌组织和癌旁组织中VEGF表达

2.3不同组织中VEGF的检测

分别检测正常组织、癌旁组织和大肠癌组织中的VEGF表达量，结果发现在癌组织中VEGF呈高表达时其淋巴管和血管内表达水平均增高(相比于正常组织时)，且有统计学差异(分别为P<0.001和P<0.05)，在癌旁组织中VEGF呈低表达(相比于癌组织)时相对癌组织，淋巴管和血管内其表达水平均降低，且有统计学差异(分别为P<0.001和P<0.05)，见图4。

a为正常组织，b为癌旁组织，c为癌组织。

3讨论

大肠癌是人类疾病中恶性程度较高的一类疾病，其主要特点是易发生转移，特别是淋巴结的转移。转移的肿瘤通过血液，淋巴管，进而形成多种其他肿瘤，淋巴管的转移包括一系列的复杂过程，包括，①原位癌恶性肿瘤细胞扩散至旁边淋巴管；②肿瘤细胞通过淋巴管转运至邻近的淋巴结；③肿瘤细胞在淋巴结中的着落；④转移性的肿瘤在淋巴结中的扩散[8]。

在最近的研究多集中在VEGF家族在大肠癌中的作用，特别是VEGF-C，VEGF-C是在1996年从人前列腺癌PC-3细胞株中分离出来，其位于染色体4q34，在其编码外端有7个外显子，是人类第一格发现的具有促进淋巴管生成的基因[9-10]。VEGF具有诱导淋巴管生成和血管新生的潜能，且能调节生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF在肿瘤发生发展和生长中发挥着重要作用[11]。VEGF主要在血管中表达，它的主要作用就是集中在促进血管新生方面，在肿瘤区域，血管新生是肿瘤发生发展的一个重要原因，所以研究VEGF在肠癌中的研究就显得尤为重要。

基于此本研究展开在大肠癌中进行VEGF的研究，检测结果发现癌组织中高表达VEGF时其淋巴管和血管内均增高(相比于正常组时)，且有统计学差异，(分别为P<0.001和P<0.05)，为了证实这种结果是VEGF造成的，我们看到在癌旁组织中VEGF低表达(相比于癌组织)，果然在低表达VEGF时其相对癌组织，淋巴管和血管内均降低，所以我们得出结果VEGF可以通过调节淋巴内皮细胞进行促进大肠癌细胞的生长。

通过本研究其很多同仁的研究必将更加证实VEGF与大肠癌细胞生长的关系，笔者认为在今后研究愈加深入后VEGF极有可能成为抑制大肠癌细胞生长的靶向药物。

参考文献

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[6]程润芬.Wnt5a信号通路在结肠癌血管生成拟态及EMT中的作用〔D〕.天津医科大学,2014.

[7]唐伟军,吴志勇,喻德洪,等.结直肠癌的实验模型〔J〕.中华实验外科杂志,2000,17(4):380-381.

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[11]Weis SM,Cheresh DA.Tumor angiogenesis:molecular pathways and therapeutic targets〔J〕.Nat Med,2011，17(11):1359-1370.

(编辑：吴小红)

Influence Mechanism of VEGF on Colorectal Cancer Cells Growth

WANGYi,ZHANGJing,LIUBei.

TianyouhospitalaffiliatedtoWuhanuniversityofscienceandtechnology,Wuhan,430064

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence mechanism of VEGF on colorectal cancer cells growth.MethodsThe related factors of colorectal cancer were screened by gene array.The expression of VEGF in colorectal cancer tissues,adjacent tissues and normal tissues were detected by immunohistochemical method.The expression of VEGF in lymphatic vessels and blood vessels of the 3 groups were detected by immunofluorescence assay.ResultsThe results of gene chip screening showed that VEGF was highly expressed in colorectal cancer tissues.The immunohistochemical results showed that VEGF was highly expressed in 22 cases of colorectal cancer tissues,compared with normal tissue,there had statistical difference,P<0.05.Immunofluorescence assay showed that the expression of VEGF lymphatic vessels and blood vessels of cancer tissues were significantly higher than that those of normal group,and there were statistically significant differences (P<0.05 and P<0.001).And VEGF was lower in tumor adjacent tissues,the lymphatic vessels and blood vessels decreased,there were significant differences(P<0.05 and P<0.001).ConclusionVEGF can regulate the endothelial lymphatic and promote colorectal cancer growth.

【Key words】VEGF;Colorectal cancer;Lymph vessel

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.012

中图分类号：R735.3+4

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)05-0737-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-21)