STAT4基因多态性与乙型肝炎病毒感染相关性肝细胞癌易感性的关系

潘明洁　刘　懿　周乙华

210008 南京大学医学院附属鼓楼医院



STAT4基因多态性与乙型肝炎病毒感染相关性肝细胞癌易感性的关系

潘明洁刘懿周乙华

210008 南京大学医学院附属鼓楼医院

【摘要】目的分析信号传导与转录激活因子4(STAT4)基因多态性与中国人群肝细胞癌(HCC)易感性的关系。方法154例乙型肝炎病毒(HBV)感染相关HCC为肝癌组，135例性别及年龄匹配的HBsAg阳性患者为非肝癌组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，检测STAT4 rs7574865位点的基因型，并经测序分析验证。Logistic回归分析比较不同基因型与HCC易感风险的关系。结果STAT4 rs7574865 位点3种基因型TT、GT、和GG型在肝癌组的分布频率分别是5.8%(9/154)、37.0%(57/154)和57.1%(88/154)，在非肝癌组分别是8.9%(12/135)、43.7%(59/135)和47.4%(64/135)。各基因型在两组间差异无统计学意义(P>0.05)；以TT基因型作参照，携带rs7574865 GG型的个体HCC患病风险差异无统计学意义(OR=1.833，95%CI=0.729～4.611，P=0.221)。结论STAT4 rs7574865多态性位点可能与中国人群HBV感染相关HCC易感性无明显相关性。

【关键词】肝细胞癌；乙型肝炎病毒；信号传导与转录激活因子4；单核苷酸多态性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:704～706)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见恶性肿瘤[1]。文献报道信号传导与转录激活因子4(signal transducer and activators of transcription 4，STAT4)单核苷酸多态性与多种自身免疫性疾病相关如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和原发性胆汁性肝硬化等[2]。Jiang等[3]全基因组关联分析，发现STAT4 rs7574865与HCC易感性有关，rs7574865位点G等位基因使HBV并发的HCC发病风险增加。本文探讨STAT4 rs7574865多态位点与慢性HBV感染并发HCC易感性的关系。

1材料与方法

1.1标本来源

研究对象包括154例乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性肝癌患者和135例HBsAg阳性非肝癌患者。肝癌组来自2008年11月至2013年4月南京鼓楼医院肝胆外科住院治疗的经临床和影像学和(或)病理诊断确诊为HCC的患者。非肝癌对照组为年龄及性别匹配的无肿瘤病史的HBsAg阳性者。所有研究对象均为汉族。

1.2方法

1.2.1基因组DNA 提取研究对象外周血分离白细胞，白细胞经蛋白酶K在55℃消化3 h。用酚/氯仿2次抽提DNA，无水乙醇沉淀获得基因组DNA，提取的DNA用TE溶解。紫外分光光度计检测DNA含量，放置-20℃冰箱保存。

1.2.2STAT4基因rs7574865 G>T 位点多态性分析

应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对STAT4 rs7574865位点进行基因分型。根据参考文献[4-7]合成引物，引物序列为：上游引物5′-AAA GAA GTG GGA TAA AAA GAA GTTTG-3′，下游引物5′-CCA CTG AAA TAA GAT AAC CAC TGT-3′，PCR扩增片段为147 bp。

PCR反应体系总体积50 μL，内含基因组DNA 100 ng，dNTP 2.5 mmol/ L，10×PCR 缓冲液(包含Mgcl2)5 μL，Taq酶2 U，上、下游引物各10 pmol。PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物的限制性酶切体系总体积10 μL，PCR产物5 μL，加入Hpa I内切酶2U(NEB，北京)37 ℃水浴2 h后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离后在紫外灯下判断结果。酶切分型之后每种基因型各取3例PCR产物，DNA纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化后测序(ABI 3130，Applied Biosystems)，验证酶切方法的准确性。

1.3统计学处理

应用SPSS 18.0软件进行数据录入与统计分析。基因型和等位基因分布频率、研究对象是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用四格表χ2检验，Logistic单因素回归分析计算比值比(odds rations，OR)，95%可信区间(CI)比较不同基因型与HCC风险的相关性。均为双侧概率检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1肝癌组和非肝癌组一般情况比较

肝癌组154例，其中男性 131例(85.1%)，女性23例(14.9%)；平均年龄(51.62±10.94)岁。非肝癌组135例，其中男性109例(80.7%)，女性26例(19.3%)；平均年龄(51.94±12.90)岁。两组的性别构成比、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2STAT4 rs7574865多态性位点等位基因及基因型分布频率与HCC的关系

PCR扩增产物大小符合，酶切图谱清晰。基因型G/G纯合子酶切片段为147 bp； T/T纯合子为122 bp和25 bp两条带；G/T杂合子酶切片段应为147 bp、122 bp和25 bp三条带，但25 bp片段已经跑出胶外，因此电泳图可见两条带(图1)。每种基因型各取3例PCR产物测序，序列分析与酶切结果一致，证实酶切方法准确，结果可靠。经χ2检验，STAT4 基因rs7574865在非肝癌对照组的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，选取的标本具有人群代表性。

M为Marker；1为PCR扩增产物；2为T/T基因型；3为G/T

STAT4 rs7574865位点的3种基因型检测结果见表1。T/T、G/T、和G/G基因型在肝癌组的分布频率分别为5.8%(9/154)、37.0%(57/154)和57.1%(88/154)，在非肝癌组分别为8.9%(12/135)、43.7%(59/135)和47.4%(64/135)。各种基因型两组间差异无统计学意义(P>0.05)。等位基因T和G在肝癌组中的频率分别为24.4%(75/308)和75.6% (233/308)，对照组中频率分别为30.7%(83/270)和69.3%(187/270)，等位基因分布频率两组间比较差异无统计学意义(χ2=3.016，P=0.221)。

单因素Logistic回归分析显示，STAT4 rs7574865位点各基因型与HCC患病风险的关联性比较差异无统计学意义(P=0.223)。进一步调整年龄及性别影响因素后其差异仍无统计学意义(P=0.218)。STAT4 rs7574865位点多态性可能与HCC易感无关。

表1　两组STAT4 rs7574865基因型及等位基因分布(例，%)

3讨论

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，人群中的发生频率大于1%，是人类可遗传的变异中最常见的一种。相关基因的单核甘酸多态性可影响基因的转录或表达，导致疾病易感性的差异[8]。本研究分析STAT4基因单核苷酸多态性多态性与中国人群HCC易感性的关系。

信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transciption，STAT)是一组能与DNA结合的蛋白质，有40多种细胞多肽物质可与细胞表面的特异性受体结合，从而引发胞浆中的STATs的激活。STAT4编码的转录因子参与了多种重要细胞因子如IL-12、IFN-α/β和IL-23的信号传导过程。 IL-12、IFN-α/β通过STAT4的信号传导刺激幼稚CD4+ T细胞向Th1分化，刺激Th1产生IFN-γ[9]。IFN-γ是多效性细胞因子，在宿主免疫防御中发挥重要作用[10]。STAT4基因多态性消弱IFN-γ的活性，从而可能降低机体抗病毒和抗肿瘤活性[11]，过表达IFN-γ可能导致自身免疫性疾病的发生[12]。

Jiang等[3]三阶段包括七组病例对照(HBV感染并发肝癌+慢性HBV携带者)人群全基因组关联分析发现STAT4 rs7574865位点G等位基因与HBV并发的HCC发病风险增加(OR=1.22，95%CI=1.15 ～1.29，P=1.66×10-11)。而且SNP rs7574865 GG基因型STAT4 mRNA在HCC肿瘤组织和非肿瘤组织的表达水平低于TG基因型和TT基因型，这与文献报道STAT4 rs7574865 G等位基因降低各种自身免疫性疾病风险相一致，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和原发性胆汁性肝硬化等[2]。本研究发现rs7574865 GG基因型与HCC易感性无关，虽然GG基因型在肝癌组的频率高于非肝癌组，增加HCC风险的趋势与全基因组关联分析[3]一致，但差异无统计学意义(OR=1.572，95%CI=0.641～3.855，P=0.218)，与韩国对287例HBV感染并发肝癌和671例慢性HBV感染对照的研究结果类似[13]，同样Chen等[14]比较506例HBV感染并发肝癌，和772例慢性HBV感染者，rs7574865位点基因型在两组人群无显著区别。Clark等[15]445例越南患者包括206例慢性HBV感染和239例肝癌研究中在HCC和慢性HBV感染组以G等位基因做参比，T等位基因风险降低(OR=0.84，95%CI =0.7～0.99，P=0.048)也就是G是危险等位基因，结果与Jiang一致，但是2篇文献OR值(比值比)即相对危险度都接近1，说明rs7574865位点基因多态性对HBV肝癌易感性的影响并不明显。

本研究发现STAT4 rs7574865位点与肝癌易感性无明显相关性。肝癌的发生是1个多基因、多途径、由遗传和环境因素等综合影响的过程，有必要纳入更多的位点进行联合分析，遗传因素与环境因素的协同作用也值得更深入的研究。

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(编辑：吴小红)

Relationship between Polymorphisms of STAT4 and the Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma Associated with Hepatitis B Virus

PANMingjie,LIUYi,ZHOUYihua.

NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing,210008

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between single nucleotide polymorphism(SNP)of STAT4 and hepatocellular carcinoma(HCC)susceptibility in chinese population.Methods154 patients with hepatitis B virus(HBV)-related HCC and 135 age-and gender-matched non-HCC controls infected with HBV were enrolled.The genotypes of STAT4 rs7574865 were detected by polymerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and verified by sequencing analysis.Logistic regression model was used to analyze the relationship between different genotypes and their susceptibility to HCC.ResultsThe frequencies of genotypes TT,GT and GG on STAT4 rs7574865 were 5.8%(9/154),37.0%(57/154),57.1%(88/154)in the HCC group,and 8.9%(12/135),43.7%(59/135),47.4%(64/135)in non-HCC group,respectively,showing no statistical significance(P>0.05).Compared with TT genotype,there was no significant association at rs7574865 GG in the susceptibility to HCC(OR=1.833，95%CI=0.729～4.611，P=0.221).ConclusionThe polymorphism of STAT4 rs7574865 is not associated with susceptibility to HCC in chinese population.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Hepatitis B virus;Signal transducer and activators of transcription 4;Single nucleotide polymorphism

通讯作者：周乙华

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.003

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)05-0704-03

(收稿日期2015-08-07修回日期 2016-01-25)