miR-296在卵巢癌中的表达及其靶基因的预测研究

权效珍　兰艳丽

441021 湖北文理学院附属襄阳市中心医院



miR-296在卵巢癌中的表达及其靶基因的预测研究

权效珍兰艳丽

441021 湖北文理学院附属襄阳市中心医院

【摘要】目的观察miR-296在卵巢癌中的表达及其靶基因的预测。方法收集卵巢癌患者组织样本22例和妇科活检为正常的样本22例，在提取RNA后进行RNA纯度检测，进而检测miR-296在卵巢癌中的表达；在卵巢癌细胞中稳定转入高表达miR-296的质粒，miRNA芯片进行靶基因检测。结果卵巢癌组织中miR-296高表达，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P<0.001)。在卵巢癌细胞系中，当高表达miR-296时，microRNA143和microRNA215在转染组中高表达，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表达。结论miR-296在卵巢癌中高表达，且其潜在的靶基因有可能作为临床卵巢癌诊断的标志。

【关键词】miR-296；卵巢癌；靶基因

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:727～729)

卵巢癌被认为是常见恶性肿瘤中致死率较高的肿瘤疾病，特别是在东亚和南非国家中尤为常见，且在发展中国家中，卵巢癌患者发病率和死亡率也明显要高于其他发达国家[1-2]。卵巢癌患者的发病率是一个多因素，多步骤，复杂的过程，而且和各类妇科疾病及患者身体状况有关系[3]，但是其潜在形成恶性肿瘤的机制还未被研究清楚。microRNA被报道是一个小的非编码RNA，它可以调节RNA的转录功能，进而促进或者抑制肿瘤基因的表达[4]。到现在为止，超过1000个人类microRNA被确认而且被报道在RNA数据库中，而且有些被用来作为诊断、预后和治疗的分子生物标记物[5-6]。miR-296位于染色体20q13.32处，有研究报道miR-296的分子作用是与血管生成有关，是一个比较好的肿瘤抑制剂，参与调节细胞极性[7-8]。但是miR-296在卵巢癌中的研究较少，且关于其靶基因在卵巢癌中的研究在国内外均未见报道。

1材料与方法

1.1临床资料

收集我院肿瘤科卵巢癌患者样本22例，将妇科活检为正常的样本22例进行对照，患者各类临床资料均良好保存。

1.2方法

1.2.1Q-PCR试剂及方法逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，称取等量组织或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃离心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，静置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃离心15 min，离心完后分为3层，取最上层(中间一层为蛋白)至一新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，颠倒数次混匀；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，弃上清液，小心吸尽液体(此时可以看到白色沉淀即为RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用核酸染料法进行实时荧光定量PCR检测miR-296在卵巢癌中的表达研究。引物序列为：miR-296，F-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT；R-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG。U6，F-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG；R-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT。

1.2.2miRNA分子杂交方法采用(Ambion公司)小分子分离试剂盒分理处小分子RNA，将提取完的小分子RNA进行Cy3标记，进而与miRNA芯片进行杂交反应，miRNA芯片购自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.3稳定转染过表达的miR-296的卵巢癌细胞株

将处于对数期的SKOV3(购自于ATCC)种于六孔板中，保证每孔细胞量为3×105～8×105，lipo2000加入5 μl用100 μl无血清培养基混匀，静置5 min，同时高表达的miR-296的质粒12 μl于100 μl无血清的培养基中混匀，5 min后两者混匀20 min，然后加入1 800 μl的无血清培养基，48 h后提取RNA进行检测。过表达miR-296序列合成于广州锐博生物公司。

1.3统计学处理

用SPSS 11.0统计软件包处理，统计学方法采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1标本中RNA质量检测

在RNA检测中会经常出现RNA降解，所以在进行microRNA检测前我们进行RNA纯度的检测，其检测方法是RNA凝胶电泳检测，采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖体RNA)的2个主要亚基，在体内含量较多。28 s/18 s即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28 s/18 s为1.8～2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。电泳条带上应是28 s在上，18 s在下，且亮度为28 s是18 s的2倍。结果见图1。

图1　RNA凝胶电泳检测结果

2.2miR-296在卵巢癌中的表达

在22例卵巢癌患者和22例正常卵巢患者中检测miR-296的表达，在提取RNA后进行实时荧光定量PCR检测后，用U6作为内参，将2组miR-296的表达内参化后进行统计分析，发现在卵巢癌组织中miR-296高表达，与正常卵巢组织比较，表达存在明显差异，P<0.001，见图2。

图2　miR-296在卵巢癌组织中的表达

2.3在卵巢癌中miR-296靶基因检测

在我们的研究中发现我们所提取的RNA纯度较高，且未出现降解等情况。SKOV3是临床上经常用于科学研究的卵巢癌细胞株，在我们转染高表达的miR-296后，检测其下游的靶基因。在我们的检测中发现，microRNA143和microRNA215在miR-296转染组中高表达，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p在转染组中低表达。见图3。

中间线表示理想回归线，上下线表示理想预测的1个对数单位

3讨论

卵巢癌是1种高度恶性的肿瘤，其发病机理也比较复杂。基因的表达异常产生了肿瘤，MicroRNA在卵巢癌中的研究越来越多，也越来越深入，在卵巢癌初期miRNA的筛查中发现很多基因表达异常，许多已经被广大研究者公认为抑癌基因，当然也有很多基因被认为是促癌基因。有越来越多的microRNA被用来作为肿瘤标记物应用到临床研究上[9]。miR-296早期被用来抗血管生成的研究，其主要是通过影响细胞极性进而改变细胞运动状态，如影响极性蛋白scrib。有研究报道，当miR-296过表达时会增加肿瘤细胞的迁移和浸润[10]。

但是关于miR-296的靶基因研究还未见过多报道，特别是在卵巢癌中的研究。有研究报道miR-296可以调控VEGFR2和PDGFRβ信号通路进而影响前列腺癌的肿瘤进程，这一研究主要集中在通过miR-296的表达进而影响血管的生成，达到影响肿瘤[11-12]。卵巢癌的致死率也逐渐引起广大医疗科研工作者的重视，但是调控卵巢癌的发生发展的分子机制也相当复杂，所以寻找一个好的基因靶点显得尤为重要。

在前人的研究中已经有学者报道miR-296与肿瘤之间的关系，但是卵巢癌中的研究还未见报道。在我们的研究中发现在 RNA纯度等多方面均完好的情况下miR-296在卵巢癌中高表达，且存在明显差异。当我们转染高表达的miR-296的卵巢癌细胞系时，发现microRNA143和microRNA215在转染组中高表达，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表达。这些基因的表达差异是我们研究的创新点，据我们的实验观察可得出，这些微小RNA有可能作为卵巢癌诊断分子标记物。

参考文献

[1]朱皓皞.卵巢癌预后评估相关因素的研究进展〔J〕.实用癌症杂志,2011,26(4):429-431.

[2]Nimmo RA,Slack FJ.An elegant miRror:microRNAs in stem cells,developmental timing and cancer〔J〕.Chromosoma,2009,118(4):405-418.

[3]Folini M,Gandellini P,Longoni N,et al.miR-21:an oncomir on strike in prostate cancer〔J〕.Mol Cancer，2010,9:12.

[4]Xi Y,Shalgi R,Fodstad O,et al.Differentially regulated micro-RNAs and actively translated messenger RNA transcripts by tumor suppressor p53 in colon cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2006,12(7 Pt 1):2014-2024.

[5]Lee YS,Dutta A.MicroRNAs in cancer〔J〕.Annu Rev Pathol,2009,4(2):199-277.

[6]Yamakuchi M,Ferlito M,Lowenstein CJ.miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(36):13421-13426.

[7]Wei JJ,Wu X,Peng Y,et al.Regulation of HMGA1 expression by microRNA296 affects prostate cancer growth and invasion〔J〕.Clin Cancer Res,2011,17(6):1297-1305.

[8]Osmani N,Vitale N,Borg JP,et al.Scrib controls Cdc42 localization and activity to promote cell polarization during astrocyte migration〔J〕.Curr Biol,2006，16(24):2395-2405.

[9]孙彩霞,宋藏珠,徐庆,等.卵巢癌组织和细胞株中 miR-141表达水平与卡铂耐药性的关系〔J〕.实用癌症杂志,2014,29(11):1364-1368.

[10]Nagasaka K,Pim D,Massimi P,et al.The cell polarity regulator hScrib controls ERK activation through a KIM site-dependent interaction〔J〕.Oncogene,2010，23(38):5311-5321.

[11]Bilder D,Li M,Perrimon N.Cooperative regulation of cell polarity and growth by Drosophila tumor suppressors〔J〕.Science,2000,289(5476):113-116.

[12]Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer〔J〕.Cell,2000,100(1):57-70.

(编辑：甘艳)

Expression of miR-296 in Ovarian Cancer and Prediction of Its Target Gene Research

QUANXiaozhen,LANYanli.

XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of miR-296 expression in ovarian cancer and prediction of its target gene research.MethodsCollect our oncology patient samples 22 cases of ovarian cancer tissues,and 22 cases of normal tissues were collected.After testing the purity of RNA,we screen the expression of miR-296,in ovarian cancer were detected,and test the target gene were tested after transferred with high miR-296 by genechip technology.ResultsWe found that the miR-296 had high expression in ovarian cancer,and compared with the control had statistical significance normal,P<0.001.When transferred with high miR-296 in ovarian cancer cell lines(SKOV3),we found that that microRNA143 and microRNA215 were upregulated in the group with high expression miR-296,and microRNA96、microRNA551b and microRNA502-3p were down-regulated expression.ConclusionThe miR-296 are highly expressed in ovarian cancer,and the potential target gene may as ovarian cancer molecular marker in clinic.

【Key words】miR-296;Ovarian cancer;Target gene

通讯作者：兰艳丽

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.009

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)05-0727-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-10)