不同刺激剂对健康人和结核患者外周血T细胞产生γ干扰素和肿瘤坏死因子-α的影响

徐志庆，夏　惠，李柏青



不同刺激剂对健康人和结核患者外周血T细胞产生γ干扰素和肿瘤坏死因子-α的影响

徐志庆，夏惠，李柏青

[摘要]目的：检测健康人和结核患者外周血经不同刺激剂刺激后T细胞亚群产生γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化。方法：12名健康人和12例结核患者的外周血单个核细胞用佛波醇脂(PMA)+钙离子霉素(IM)、结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)、植物血凝素(PHA)刺激，莫能霉素阻断，流式细胞仪检测产生IFN-γ和TNF-α的T细胞亚群比例。结果：PMA+IM刺激健康人外周血αβ T细胞产生IFN-γ的比例明显高于结核患者(P<0.01)；PMA+IM、Mtb-HAg和PHA刺激健康人外周血γδ T细胞产生IFN-γ的比例高于结核患者(P<0.05～P<0.01)。PMA+IM和PHA刺激健康人外周血αβ T细胞产生TNF-α的比例均高于结核患者(P<0.05)；PMA+IM和PHA刺激健康人外周血γδ T细胞产生TNF-α的比例均高于结核患者(P<0.05)。结论：经不同刺激剂刺激后，健康人γδ T细胞产生IFN-γ的比例高于结核患者γδ T细胞产生IFN-γ的比例。经PMA和PHA刺激后，健康人αβ T和γδ T细胞产生TNF-α的比例高于结核患者。

[关键词]结核分枝杆菌；T细胞亚群；γ-干扰素；肿瘤坏死因子-α；流式细胞仪

结核病严重危害人类健康，全世界结核病每年发病830万人，死亡180万人。第四次全国结核病的调查结果显示，我国超过5亿人感染了结核分枝杆菌(Mtb)，占全国总人口的44.5%[1]。开发早期、快速、准确诊断结核病的实验技术十分重要。近年来,结核感染的实验室诊断不断取得进展,尤以γ干扰素(IFN-γ)为基础的免疫学诊断研究最为广泛，其对结核病的诊断有较好的敏感性和特异性[2]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由单核细胞和巨噬细胞产生的多肽类细胞因子，在炎症反应、免疫系统的发展、细胞程序性死亡和脂代谢中起重要作用，在结核病的免疫机制中也扮演着重要的角色。本文就健康人和结核患者外周血T细胞经不同刺激后产生的IFN-γ和TNF-α进行测定，分析其变化和意义。

1材料与方法

1.1样本资料12名健康人外周血标本来自蚌埠市中心血站健康志愿者,男6名，女6名，年龄18～65岁。12例结核患者外周血标本来自蚌埠市传染病医院，男6例，女6例，年龄36～85岁，经临床诊断为肺结核。每份标本的采集均征得本人书面同意。

1.2主要试剂及仪器培养基 RPMI1640购自GIBCO 公司产品。佛波醇酯(Phorbo 12-myristate 13-acetate，PMA)、钙离子霉素(ionomycin，IM)、莫能霉素(monensin，Mo)均购自 Sigma-Aldrich 公司。植物血凝素(PHA)购自 Sigma 公司。结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)为本实验室自制。抗-CD3-APC购自MACs公司，抗-TCR-γδ-TC，抗-IFN-γ-FITC、抗-TNF-α-PE均购自Invitrogen 公司。流式细胞仪：FACS Calibur，美国BD公司。

1.3细胞处理从血站取回健康志愿者的抗凝外周血灭菌PBS混匀。Ficoll淋巴细胞分离液常规分离单个核细胞。20%DMSO及纯血清重悬。加入标记好的冻存管中，每管1 mL，封口膜密封，放入-80 ℃冰箱过夜，第2天移至液氮罐中，使用时复苏。结核患者抗凝外周血取自传染病医院，取回后立即按0.5 mL与等体积不完全RPMI1640混匀后加入不同的刺激剂，PMA刺激6 h，Mtb-HAg和PHA刺激20 h后收集细胞进行检测(即健康志愿者刺激时用复苏的淋巴细胞，结核患者刺激时用全血，因结核患者血量较少)。每组细胞均设置同型对照组。

1.4统计学方法采用t检验。

2结果

2.1不同刺激剂刺激健康人和结核患者外周血T细胞不同亚群产生IFN-γ比较健康人及结核患者外周血T细胞经不同刺激后，αβ和γδ T细胞2个亚群均能产生IFN-γ。PMA+IM刺激健康人外周血αβ T细胞产生IFN-γ的比例高于结核患者组(P<0.05)；PMA+IM、Mtb-HAg和PHA刺激健康人外周血γδ T产生IFN-γ的比例均高于结核患者组(P<0.05～P<0.01)(见表1、2及图1、2)。

2.2不同刺激剂刺激健康人和结核患者外周血T细胞不同亚群产生TNF-α的比较健康人及结核患者外周血T细胞经不同刺激后，αβ和γδ T细胞2个亚群均能产生TNF-α。 PMA+IM和PHA刺激健康人外周血αβ T细胞产生TNF-α的比例高于结核患者组(P<0.05)；PMA+IM和PHA刺激健康人外周血γδ T细胞产生TNF-α的比例均高于结核患者组(P<0.05)(见表3、4及图3、4)。

3讨论

TNF是一类由激活的巨噬细胞、淋巴细胞等细胞所分泌的细胞因子，具有广泛的生物活性。结核病是一种与免疫病相关的感染性疾病，多种细胞因子参与结核病的免疫应答及病理过程，其中TNF-α是一种重要炎症因子。TNF-α在结核杆菌感染中起到保护性免疫和致炎的双重作用[3-4]；在结核患者在血清水平、病灶组织中和基因水平的TNF-α表达量均与正常人有差异；TNF-α能显著诱导巨噬细胞抑制结核杆菌生长,并引起机体产生有效的肉芽肿应答[5-8]。

以往研究[9-10]表明，Mtb感染宿主后诱导CD4+和 CD8+αβ T 细胞的特异性免疫应答，并激活巨噬细胞发挥免疫效应作用。但这些细胞承担保护性免疫和参与结核病发病的详细机制，并未得到满意的解释。近年来，对天然免疫细胞参与抗Mtb感染的免疫保护作用或结核病发病机制的探讨，逐渐受到关注。其中具有天然免疫样作用的 γδ T 细胞在结核感染中的免疫作用，已得到众多研究者的实验研究和临床观察的证实[9-10]。

本研究结果显示，Mtb-HAg和非特异性刺激剂(PMA+IM、PHA)均可以刺激外周血中T细胞亚群产生IFN-γ,其中健康人产生IFN-γ的γδ T细胞比例比结核患者高。说明Mtb感染会导致体内IFN-γ水平的下降。因为Mtb主要寄生于巨噬细胞内，IFN-γ 对于单核巨噬细胞是一种较强的激活剂，能使巨噬细胞产生抗菌分子来发挥杀灭结核杆菌的作用。机体内IFN-γ随着抗结核的治疗进行而发生变化。在治疗开始时，IFN-γ产生较少，但抗结核治疗2个月后回复正常，并一直保持到疗程结束[11]。结核患者免疫功能低下，免疫功能低下又会加重结核病情，两者互为因果，造成恶性循环。不管是在健康人还是结核患者，产生IFN-γ的γδ T细胞比αβ T细胞要高，进一步说明γδ T细胞在抗Mtb感染过程中起到重要作用。

本实验结果还提示，健康人产生TNF-α的T细胞比例比结核患者高。TNF-α是控制Mtb感染的重要细胞因子，它的过量产生会导致免疫病理性疾病，表达下降则会造成Mtb大量繁殖。巨噬细胞感染Mtb后产生TNF-α,TNF-α对结核感染的保护性免疫起着十分重要的作用，其对防止持续性结核病再燃也有重要作用。从流式结果初步显示，当人体感染结核病时，体内产生TNF-α的量会下降，有可能经过治疗后会上升，最终达到正常水平量。因此，检测结核患者外周T细胞不同亚群产生TNF-α的比例，可以在一定程度上提示结核患者的免疫状态，例如，当结核患者外周血T细胞亚群产生IFN-γ、TNF-α的比例与刚入院时有升高，可能提示患者免疫状态有所好转。

[参考文献]

[1]全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25(1)：3.

[2]文霞,柳爱华,宝福凯,等.γ-干扰素释放试验应用于结核病诊断的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2011,6(7):542.

[3]JACOBS M,TOGBE D,FREMOND C,etal.Tumor necrosis factor is critical to control tuberculosis infection [J].Microbes Infect,2007,9(5):623.

[4]EHLERS S,BENINI J,KUTSCH S,etal.Fatal granuloma necrosis without exacerbated mycobacterial growth in tumor necrosis factor receptor p55gene deficient mice intravenously infected withMycobacteriumavium[J].Infect Immun,1999,67(7):3571.

[5]付瑞全,韦振空.42例肺结核患者免疫学指标检测结果分析 [J].医学文选,2005,24(5):679.

[6]TSAO TC,HONG J,HUANG C,etal.Increased TNF-α,IL-1β and IL-6 levels in the bronchoalveolar lavage fluid with the upregulation of their mRNA in macrophages lavaged from patients with active pulmonary tuberculosis [J].Tuber Lung Dis,1999,79(5):279.

[7]BOTHA T,RYFFEL B.Reactivation of latent tuberculosis infection in TNF-deficient mice [J].J Immunol,2003,171(6):3110.

[8]KEANE J,GERSHON S,WISE RP,etal.Tuberculosis associated with infliximab,a tumor necrosis factor α-neutralizing agent [J].N Engel J Med,2001,345(15):1098.

[9]LALVANI A,PATHAN AA,McSHANE H,etal.Rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisinfection by enumeration of antigen specific T cells[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163(4):824.

[10]LALVANI A.Spoting latent infection:the path to better tuberculosis control[J].Thorax,2003,58(11):916.

[11]张天托,川上和羲,唐春英,等.白介素12调节小鼠Th1/Th2的抗结核分枝杆菌感染研究 [J].中华结核和呼吸杂志,2003,23(7):358.

(本文编辑姚仁斌)

Comparision of the different stimulants on the peripheral blood T cells of healthy people and tuberculosis patients producing interferon-γ and tumor necrosis factor-α

XU Zhi-qing,XIA hui,LI Bai-qing

(DepartmentofImmunology,BengbuMedicalCollege,AnhuiKeyLaboratoryofInfectionandImmunity，BengbuAnhui233030,China)

[Abstract]Objective:To detect the changes of the different stimulants on the peripheral blood T cell subsets of healthy people and tuberculosis(TB) patients producing interferon-γ(IFN-γ) and tumor necrosis factor-α(TNF-α).Methods:The proportion of T cell subsets producing INF-γ and TNF-α in 12 healthy people peripheral blood mononuclear cells and 12 TB patients peripheral blood stimulated with PMA combined with ionomycin,Mtb-Hag,PHA and blocked with monensin were detected using the flow cytometry.Results:The proportion of INF-γ produced by αβ T cells of peripheral blood stimulated with PMA in healthy people was significantly higher than that in TB patients(P<0.05).The proportions of INF-γ produced by γδ T cells of peripheral blood stimulated with PMA,Mtb-Hag and PHA in healthy people were higher than that in TB patients(P<0.05 to P<0.01).The proportions of TNF-α produced by αβ T cells of peripheral blood stimulated with PMA PHA in healthy people were higher than those in TB patients(P<0.05).The proportions of INF-α produced by γδ T cells of peripheral blood stimulated with PMA and PHA in healthy people were higher than that in TB patients(P<0.05 ).Conclusions:After stimulated with different stimulants,the proportion of INF-γ produced by γδ T cells in healthy people is higher than that in TB patients.After simulated with PMA and PHA,the proportion of TNF-α produced by αβ T cells and γδ T cells in healthy people is higher than that in TB patients.

[Key words]Mycobacterium tuberculosis;T cell subset;interferon-γ;tumor necrosis factor-α;flow cytometry

[文章编号]1000-2200(2016)03-0288-04·基础医学·

[收稿日期]2014-02-24

[基金项目]国家自然科学基金项目(81072426)

[作者简介]徐志庆(1988-),女，硕士研究生.[通信作者] 李柏青，博士硕士研究生导师，教授.E-mail:baiqingli@bbmc.edu.cn

[中图法分类号]R 378.911

[文献标志码]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.003

[作者单位] 蚌埠医学院 免疫学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，安徽 蚌埠 233030