结核病DNA疫苗研究进展

薛玉芹，方　强



结核病DNA疫苗研究进展

薛玉芹，方强

[关键词]结核病；DNA疫苗；综述

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的以呼吸道为主的一种传染性疾病，严重危害人类健康。随着医学科学技术的发展，人类对抗TB已取得了一定的成果，包括有效的治疗药物及疫苗的研发。但同时由于Mtb耐药的严重性、人类免疫缺陷性病毒(HIV)与Mtb的双重感染及流动人口的日益增多、吸毒等，加上不少国家对TB的忽视，TB在全球范围内呈回升趋势。世界卫生组织发布的《2012年全球结核病控制报告》[1]指出，虽然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趋势，但每年仍有数百万TB新发病例，2011年全球新增TB患者870万人，死于TB的人数为140万人，其中新增TB患者中有3.7%患有耐多药TB，全球TB负担仍然十分严重。

至今，卡介苗(BCG)仍是被批准使用的预防TB的唯一疫苗，其保护力不稳定，差异大，究其原因可能受BCG菌株差异、感染Mtb菌株的差异性、Mtb的内源性复燃和外源性再感染以及接种人群和临床试验方法的差异性等的影响[2]。随着免疫学和分子生物学的迅速发展，新型的TB疫苗已得到广泛研究，如活疫苗、亚单位疫苗(DNA疫苗、重组蛋白疫苗等)和灭活疫苗等，其中DNA疫苗以其安全、经济、有效等优点，成为近年来TB疫苗研究的热点之一，本文就TB DNA疫苗的研究进展作一综述。

1DNA疫苗的概念及免疫机制

1.1DNA疫苗的概念DNA疫苗是指把能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原编码的外源基因和真核表达载体连接，通过某种方法导入机体，通过宿主细胞的转录翻译合成抗原蛋白，诱导机体产生对该抗原的体液免疫和细胞免疫反应，以达到预防和/或治疗疾病的目的。WOLFF等[3]研究发现小鼠的骨骼肌细胞能捕获不加任何处理的外源基因并在一定时间内表达，并能诱发小鼠产生相应的细胞与体液免疫反应，从而开辟了核酸疫苗学的新天地。DNA疫苗按其应用目的可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。

1.2DNA疫苗的免疫机制目前认为，TB DNA疫苗被直接导入宿主体内后，在细胞内表达Mtb蛋白抗原，加工形成多肽抗原，与宿主细胞MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子结合，递呈给宿主的免疫识别系统，引起特异性细胞和体液免疫应答，特别是细胞毒体细胞应答反应。组织细胞摄入质粒DNA后，在细胞核内转录成mRNA,再在细胞质内翻译成抗原蛋白分子。一部分内源性抗原蛋白结合到泛肽上，被蛋白酶降解为多肽，通过肽转运结构(TAP)转运至内质网，形成多肽-MHC-Ⅰ类分子聚合物，最后到达细胞膜表面，借助TCR受体被CD8+细胞识别，诱发CD8+CTL T细胞应答；同时，部分抗原从抗原提呈细胞(APC)的细胞膜进入，通过MHC-Ⅱ递呈途径，被APC溶酶体降解为多肽，最后形成成熟的MHC异聚体，在细胞膜表面，被CD4+T细胞识别，引起细胞免疫和体液免疫应答。其中，还有一部分抗原多肽递呈给B细胞，激活B细胞，部分转化为浆细胞，产生特异性抗体，引发体液免疫[4-6]。

2TB DNA疫苗的种类

2.1TB预防性DNA疫苗疫苗的最初目的是为了预防疾病的发生，DNA疫苗也是如此。TB DNA疫苗的研究目的也是由于BCG保护力不稳定，而作为第二代疫苗的重组蛋白亚单位疫苗诱发细胞免疫应答的能力较弱，对TB的预防并不理想，需要研发能够全面诱发体液免疫和细胞免疫的新型疫苗来预防TB的发生。近年来，随着对结核菌致病机制认识的深入，预防性DNA疫苗的研制目标不仅限于针对正常人群抗结核杆菌感染的预防，更重要的是要研发针对潜伏期感染的疫苗，达到抑制、清除潜伏感染的细菌，防止TB复发也是其重要的目标[7]。目前，已有多种TB预防性DNA疫苗在动物实验中获得了较理想的效果。

2.2TB治疗性DNA疫苗由于化疗药的不良反应和耐多药结核菌株的流行等，TB的免疫治疗引起了学者的广泛关注。治疗性疫苗是指接种于已感染病原体的个体，发挥主动免疫，成为近年来控制传染性疾病的新方向[8]。 TB治疗性疫苗的目的是诱导和增强细胞介导的免疫反应，杀死细胞内寄生的Mtb，DNA疫苗在细胞内生成内生性抗原，不仅能诱导体液免疫和TH1型细胞免疫应答，还能诱导特异性的CTL应答，能将低效的抑菌反应转换成高效的杀菌作用。日本科学家[9]将白细胞介素(IL)-6相关基因连接到腺病毒载体，构建IL-6相关DNA疫苗，采用该疫苗治疗小鼠后，发现其肺部Mtb数目明显低于BCG东京株，且能激发CTL活性，具有显著的治疗效果。目前在TB疫苗研制中备受关注的Ag85分泌性抗原，梁艳等[10-11]证明Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型DNA疫苗与药物联合使用能显著提高药物对耐药Mtb感染的治疗效果。其中，Mtb早期表达的蛋白，适应宿主体内的免疫环境，成为免疫系统的诱导蛋白，因此在潜伏感染期首次表达的蛋白(休眠期蛋白)是治疗性疫苗表达的重要抗原，但目前研究甚少，主要包括休眠相关基因热休克蛋白(HSP)X、休眠相关蛋白(Dormancy-related，DosR)等。有研究[12-13]证明，HSP65与IL-12编码基因融合表达构建的DNA疫苗，在治疗TB小鼠的实验中，能显著提高TH1细胞免疫反应，减少Mtb的数目。

3结核DNA疫苗研究的主要疫苗候选基因

3.1DosR编码基因DosR是由Rv3407基因编码，是Mtb从潜伏期转化到再活化状态时产生的特异性蛋白，对潜伏期人群有明显的保护作用[14]，是治疗性疫苗的重要抗原。有研究[15-17]发现，Rv3407能诱导Mtb潜伏期的特异性记忆T细胞分泌干扰素(IFN)，构建的 PVAX1-Rv3407 DNA 疫苗，通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，能诱导宿主产生细胞免疫和体液免疫应答，对Mtb的潜伏期感染状态，产生高效的T细胞免疫。研究[18]报道，Mtb休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制备的疫苗具备有效预防潜伏期感染结核菌的复活。

3.2HSP编码基因HSP又称“分子伴侣”，属于胞质蛋白，是被免疫系统识别的重要抗原，其编码基因是研究最早的DNA疫苗候选分子之一，近年来被用来研究DNA疫苗的主要是HSP65、HSP70编码基因。二者质粒DNA疫苗既可用作预防性疫苗又可作为治疗性疫苗。ANDEREN等[19-20]构建了HSP65与人IL-2融合基因的DNA疫苗，研究发现其能诱导产生大量的IFN-γ和IL-2和特异性的IgG2a抗体，在用于治疗TB小鼠模型时，能明显降低Mtb的数目，提高TH1型细胞免疫反应。胡方靖等[21]构建pIHsp65GM真核表达质粒并研究其DNA疫苗的免疫原性和对感染Mtb小鼠的免疫保护效果，研究表明，pIHsp65GM DNA疫苗能诱导小鼠产生特异性的IgG，脾淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ，且脾、肺载菌量均低于对照组。HSP70具有基因佐剂作用，有多个T细胞和B细胞表位，免疫原性比Hsp65更强，可诱发特异性Th1反应。LOWRIE等[22]研究发现，用HSP-70 DNA疫苗治疗感染Mtb的小鼠，其HSP-70DNA疫苗可诱导IFN-γ的产生和特异性的CTL活性，小鼠脾、肺菌落数显著低于对照组。史小玲等[23]把Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗接种于用H37Rv强毒株攻击后的小鼠，研究表明该疫苗具有良好的免疫治疗作用。

3.3Ag85复合物编码基因Ag85复合物是Mtb和BCG主要的分泌性蛋白，由Ag85A、Ag85B、Ag85C三个组分构成。在Ag85编码基因构建的DNA疫苗中，Ag85A和Ag85B效果为佳，Ag85C基因重组的DNA疫苗效果不及Ag85A和Ag85B[24]。Ag85A和Ag85B含有数个T细胞抗原决定簇，可诱导感染鼠产生Ⅳ型超敏反应(DTH)和保护性免疫。HA等[25]将Ag85A DNA疫苗及IL-12用于感染TB小鼠的治疗，发现该疫苗和药物联合治疗能显著减少小鼠TB的复发。此外，国内研制的Ag85A DNA疫苗，正在进行中试工艺研究中[26]。

3.4MPT64编码基因MPT64编码基因位于RD2区，在某些BCG菌株缺失，编码的分泌性MPT64蛋白是重要的T细胞抗原和B细胞抗原，能诱导Mtb感染的豚鼠发生很强的DTH反应。KAMATH等[27]首次将MTP64 DNA疫苗经肌内注射免疫小鼠，在间隔免疫过程中血清特异性抗体滴度逐渐升高，可诱导脾细胞产生IFN-γ和特异性的CTL活性。梁艳等[11,28]比较Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B 4种DNA疫苗的免疫原性发现，4组DNA疫苗肌内注射后均可在体内表达，MPT64DNA疫苗诱导的抗体水平最高。但与IL-12或IFN-γ质粒DNA同时免疫时，抗体水平无明显增加，证明MPT64DNA疫苗与细胞因子共刺激后，细胞因子可降低小鼠对其疫苗的抗原特异性抗体反应，而转为以诱导细胞免疫为主。

3.5PstS编码基因Mtb磷酸盐特异转运系统(phosphate-specific transport system，PstS)包括3个磷酸盐结合蛋白,分别称为PstS-1(也称为蛋白抗原b)、PstS-2、PstS-3，PstS 基因所构建的DAN疫苗免疫小鼠后可产生特异性的抗体和诱导TH1型细胞免疫应答，产生IL-12及IFN-γ等，其中PstS-1 DNA疫苗免疫不能激发细胞免疫应答，PstS-3 DNA免疫可产生较高水平的免疫应答，接受H37Rv强毒株攻击后，脾、肺菌数量明显减少，PstS-2 DNA免疫产生的免疫水平介于中间[29]。

3.6RD1区优势抗原ESAT6、CFP10编码基因BCG缺失的RD1区，仅存在于致病性分枝杆菌和一些非典型分枝杆菌。RD1区同一操纵子的ORFs Rv3875和Rv3874分别编码的ESAT6和CFP10，是RD1区核心抗原，可诱导T细胞，PBMC、NK及TB患者PBMCs产生强烈的IFN-γ[30]，具有良好的抗原性，而全部BCG都缺失这两种蛋白，使其成为当今TB疫苗研制的热点候选分子。有研究[31-32]表明，ESAT6和CFP10可使感染Mtb的小鼠体内记忆效应T细胞增殖及在感染早期即可产生高水平的IFN-γ。张海等[33]构建的Mtb ESAT6-CFP10融合DNA疫苗免疫小鼠后，能诱导产生较强的细胞免疫应答，产生的IFN-γ与对照组BCG相比无明显差异，可产生较好的免疫效果。WANG等[34]将泛素和ESAT6基因融合，研究发现，该DNA疫苗显著增加了细胞免疫应答，提供了较好的保护作用。

4提高TB DNA疫苗免疫效力的策略

众多研究表明，TB DNA疫苗免疫效力不高，单一Mtb抗原的DNA疫苗的保护效果一般不及BCG，严重制约着DNA疫苗的发展。增强DNA保护效应的方法除了选择更为有效的保护性抗原和多种抗原联合免疫或采用Prime-Boost免疫策略[35](即初次用DNA疫苗免疫，再次用BCG、抗原蛋白或抗结核药物加强免疫)等方法外，表达载体与佐剂的选择以及免疫途径也至关重要。

4.1DNA疫苗载体的选择及优化自TB DNA疫苗研究以来，质粒作为其研究载体仍然占重要地位。人们通过优先选择具备基因特异性的强启动子、功能性剪接体和受体位点的内含子、特异有效的非甲基化CpG序列以及影响真核生物表达的Kozak序列等的质粒[36-39],构建优化质粒载体的DNA疫苗。近年来，随着载体应用研究的深入，病毒载体以其可在宿主体内长期、稳定的表达目的基因的优势，成为DNA疫苗表达载体研究的热点。最新研究[40-41]报道的一种ESAT6新型DNA疫苗，可表达ESAT6T细胞表位的减毒流感病毒A/New Caledonia/20/99株活疫苗可诱导ESAT6的高水平的抗血清抗体滴度，表明病毒样颗粒作为展示表位载体的有效性和可操作性。目前，病毒性载体的研究主要以腺病毒和痘病毒为主。

慢病毒载体具备能感染分裂期细胞和非分裂期细胞，携带的外源基因表达水平高，容纳外源目的基因的片段大等优点。其中腺病毒具有强有力的免疫原性和佐剂作用，可诱发CD8+T细胞的细胞免疫反应[42]和特异性的记忆免疫反应，有研究者[43]认为第5型腺病毒用于结核疫苗的研究具有广泛性,但5型腺病毒在人群中有高度流行性，感染后的人体易产生中和抗体，削弱流行区的疫苗效率，而35型是非流行株，用途较为广泛；痘病毒具有接种一次，就能获得长期免疫效果的优点。目前，已有众多实验研究表明用该两种病毒载体构建的TB DNA疫苗的优势性和有效性，如ESAT6的重组腺病毒DNA疫苗，用于感染小鼠的免疫治疗，发现其肺部的细菌数和病灶的炎症反应程度减少[44]；以痘病毒为载体的重组Ag85A DNA疫苗目前已进入临床二期试验[45]。

此外，病原体与感染宿主在密码子使用偏嗜性方面的差异可能导致外源性蛋白表达偏低，从而导致DNA疫苗的诱发免疫效应偏低，这已成为DNA疫苗发展的重要瓶颈之一。随着生物技术手段的发展，密码子优化技术为研制有效的TB DNA疫苗提供了新思路。密码子优化是指在不改变所编码蛋白的氨基酸序列的前提下，利用序列定点突变或全基因合成的方法，改变保护性抗原基因的稀有密码子，使之更适合在真核宿主细胞内高效表达，刺激宿主产生更强的免疫应答和保护力。在TB疫苗研究中，LAKEY等[46]将Mtb85A、85B及超氧化物歧化酶(SOD)在大肠埃希菌中使用率低的密码子进行优化，发现85B蛋白表达量增加约54倍，85A和SOD蛋白表达量提高4～6倍。KO等[47]对MtbAg85B抗原基因优化，构建人源化的Ag85BDNA疫苗，体内外试验均提示，优化后的Ag85B蛋白表达量显著提高，且优化后hAg85BDNA疫苗可诱导小鼠产生更强的Th1和CTL免疫反应应答，产生更好的保护效应。本实验室将CFP10和ESAT6基因进行优化，构建CFP10/PVAX1和ESAT6/PVAX1重组DNA疫苗，通过与优化前比较，观察其免疫效应及保护力是否有所提高。这将是一个有意义的尝试，目前该研究正在进行之中。

4.2免疫佐剂TB DNA疫苗的使用可以不联合佐剂，但合适的佐剂在某种程度上可解决其免疫原性低的问题，提高其免疫效应和保护力，减少疫苗的免疫剂量和免疫次数。佐剂从最初的铝盐佐剂、弗氏佐剂，到各种新型佐剂已取得了迅速的发展，目前临床上批准用于人体的佐剂主要是铝佐剂和MF59两种。其次，细胞因子IL-2、IL-12、IL-18等可促进TH1反应，在TB DNA疫苗的发展中也发挥了重要作用。SHI等[48]将Hsp65基因与人IL-2融合构建DNA疫苗，研究显示对感染Mtb的小鼠具有很好的保护效果。李晖等[49]将Mtb8.4/hIL-12嵌合DNA疫苗免疫小鼠，与BCG和Mtb8.4疫苗相比免疫作用增强。结核菌DNA中未甲基化的CpG序列一方面可诱导B细胞的增殖分化，同时还可激活T细胞、巨噬细胞等分泌细胞因子，诱发以TH1为主的体液免疫和细胞免疫应答。

此外，泛素、单磷酰脂(MLA)、IC31以及一些新型的复合佐剂如CAF01、TBD等可诱导有效的细胞免疫应答和免疫保护效应[50-53]。目前作为免疫佐剂热门研究领域的Toll样受体(TLR)激动剂，可介导即时的非特异性的抗病原体反应，并能通过相应的信号通路和免疫调节网络调节特异性免疫反应，发挥佐剂作用，在疫苗研究中已有所研究[54-55]。随着纳米技术在生物医学中的发展，纳米材料以其具有易于加工修饰、促进功能分子入胞、保护DNA和蛋白质等降解，延长在血液的循环时间等优点，作为载体或佐剂在增强抗原免疫原性方面具有巨大的潜力，目前已有相关纳米粒子作为佐剂在DNA疫苗中的一些研究[56-59]。

4.3免疫途径DNA疫苗的免疫途径有多种，不同的免疫途径可影响抗原的吸收和表达，诱导的免疫强度和免疫机制也不同[60]。早期DNA疫苗采用的常规肌内注射法，其骨骼肌细胞摄取DNA后，可长时间持续表达，且肌肉接种诱发的免疫以TH1型为主，激活CTL、TH1细胞及产生IgG2a为主的B细胞[61]，但质粒DNA注射后，由于肌束膜的影响，仅有1%～2%的肌纤维被转染，大部分DNA未能进入细胞内，只留在细胞间隙被降解，摄取量极低。所以，有研究者通过肌内注射联合体内电转染技术来提高质粒DNA的摄取量，增强免疫应答反应。体内电转染(又称体内电穿孔、电转化、电脉冲)是通过脉冲电流增加靶细胞的渗透性，使DNA易透过细胞膜，而不损害靶细胞，解决质粒DNA在灵长类动物体内转染效率低的问题。有研究[62]将质粒DNA疫苗经肌内注射后立即施加方型波电脉冲，发现肌内注射10 μg DNA疫苗加电转染，能诱导出与不加电转染接种100 μg DNA疫苗相似或更强的抗体免疫应答，表明使用电转染技术可减少DNA疫苗的剂量和成本。

此外，新的免疫途径如基因枪法、黏膜免疫途径法、口服纳米乳或微针阵列经皮免疫途径等目前处于大量试验阶段，对未来DNA疫苗的发展具有巨大的潜力。

5结语

TB DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，近年来已经取得了可喜的进展，其可作为预防性疫苗，也可作为治疗性疫苗，被认为在TB防治中占有很大的优势。但同时也存在着一些问题：一是目前TB DNA疫苗的研究主要局限于小鼠和豚鼠模型，很少用灵长类动物模型，所以要想在临床试验中取得突破，还有很长的一段路要走；二是疫苗的安全问题，疫苗应用中不良反应的报道越来越多，主要包括免疫抑制、超敏反应及自身免疫等。因此，在日后的DNA疫苗研究进程中，我们要继续探求合适的保护抗原和载体，摸索最适宜的免疫策略、途径以及免疫剂量，充分利用佐剂的作用，将研发的新型疫苗免疫多种动物模型，进一步研究其保护性免疫机制，建立有效的体内和体外疫苗评价模型，同时建立量化的免疫毒理学评价指标[63]。我们相信，随着DNA疫苗的免疫学机制和免疫策略的深入研究，人类定能克服困难，逐个攻破难题，研制出安全有效、经济合理的DNA疫苗用于TB的预防和治疗。

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(本文编辑姚仁斌)

[文章编号]1000-2200(2016)03-0408-06·综述·

[收稿日期]2013-12-25

[基金项目]国家自然科学基金项目(30600518/C030112)

[作者简介]薛玉芹(1985-)，女，硕士研究生.[通信作者] 方强，博士，硕士研究生导师，教授.E-mail：fq333@sohu.com

[中图法分类号]R 378.91

[文献标志码]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.043

[作者单位] 蚌埠医学院 病原生物学教研室，感染与免疫安徽省重点实验室，安徽 蚌埠 233030