大鼠下颌持续前导后髁突软骨骨形态发生蛋白-2的表达*

秦　波, 润　丹， 徐卫华

(贵州医科大学附属口腔医院 正畸科， 贵州 贵阳　550004)



大鼠下颌持续前导后髁突软骨骨形态发生蛋白-2的表达*

秦波, 润丹， 徐卫华*

(贵州医科大学附属口腔医院 正畸科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨大鼠下颌持续功能前导后髁突软骨各部位骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达。方法： 40只35 d龄雄性SD大鼠均分为实验组和对照组，实验组大鼠24 h戴自制功能性矫治器引导下颌前伸，对照组不做处理；于实验后第3、7、14及28天时处死大鼠，采用免疫组化方法观察髁突软骨前、中、后各部位骨组织中BMP-2的表达。结果： 随着观测时间点后移，对照组中髁突软骨前、中、后部的BMP-2阳性细胞数逐渐减少，实验组BMP-2阳性细胞数逐渐增加，差异无统计学意义(P>0.05)；各时点同组大鼠髁突软骨后部BMP-2表达阳性细胞数高于中部和前部(P<0.05)；从第7天起，实验组BMP-2表达阳性细胞数高于同时间点同部位对照组，差异有统计学意义(P<0.05、0.01)。结论： BMP-2可能参与了下颌骨髁状突骨改建过程；但对不同部位软骨的改建可能不同。

[关键词]髁突软骨； 下颌前导； 骨形态发生蛋白-2； 免疫组化； 大鼠，Sprague Dawley

髁突的生长改建直接影响下颌的形态和功能，髁突软骨与关节盘直接接触，其改建直接反映了外力对髁突的影响。。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)能够诱导人或动物间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织, 是骨组织形成过程中最为关键的调节因子。在结构正常的组织中，BMP-2处于较低水平；在创伤、机械力刺激的情况下， BMP-2浓度增高，参与促进间充质细胞向成软骨细胞及骨细胞转化。吴拓江等研究表明髁突软骨BMP-2的表达强弱与机械应力大小有关，髁突软骨中BMP-2来自成骨细胞、软骨细胞和间充质细胞，通过检测软骨中BMP-2的表达可以反映成骨的活跃程度。本研究通过模拟临床功能矫治器，建立大鼠下颌持续前导的动物模型，造模后检测不同时间点大鼠髁突软骨前、中和后部骨组织中BMP-2的表达，探讨BMP-2对髁突不同部位软骨骨改建的影响。

1材料与方法

1.1动物与材料

选择健康雄性35 日龄 SD大鼠(贵州医科大学动物实验中心提供)40只，随机均分为实验组和对照组。骨形态发生蛋白2抗体 (武汉博士德生物工程有限公司)，增强型(Polink-1)检测试剂盒、PV-6001 兔两步法检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)及浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2方法

按照参考文献制作大鼠咬合前导装置，实验组模拟临床功能矫治器引导下颌前伸。对照组不做处理，所有动物自由饮水、饮食，同环境下饲养直至实验结束。分别于实验后第3、7、14及28天时，给予0.3%戊巴比妥钠10 mL/g剂量腹腔注射全麻下处死大鼠，5只/组，分离组织，整块取下髁状突。10%福尔马林溶液固定24 h，EDTA液脱钙4周，常规脱水，石蜡包埋。石蜡纵向切片，脱水 ，抗原修复，去离子水孵育10 min(阻断内源性过氧化物酶)，PBS液洗3次，3 min/次，加一抗后 4 ℃过夜，次日，PBS液洗3次，2 min/次，加入兔IgG抗体-HRP多聚体工作液37 ℃孵育 30 min ，PBS液洗3次，2 min/次，DAB显色，ddH2O终止显色，苏木素染色处理30 s，ddH2O冲洗，酸酒精处理10 s，氨酒精脱水透明1 min，树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，大鼠气管软骨组织作为阳性对照，细胞胞浆显示特异黄色或棕黄色为染色阳性。在光学显微镜下应用Pixera PVC100C系统采图，Photoshop 8.0软件分别选取髁突软骨前、中、后部进行观测，每部分选择连续3个100 px×100 px区域，计数各区域棕色深染的阳性细胞数。

1.3统计学处理

2结果

随着观测时间点后移，对照组中髁突软骨前、中、后部的BMP-2表达阳性细胞数逐渐减少，实验组逐渐增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；同组内，大鼠髁突软骨后部BMP-2表达阳性细胞数高于中部和前部(P<0.05)；从第7天起，实验组BMP-2表达阳性细胞数高于同时间点同部位对照组，差异有统计学意义(P<0.05、0.01)。见表1。

表1　大鼠下颌持续前导后髁突软骨各部位及不同时间BMP-2阳性细胞数±s)

(1)与同组内后部比较，P<0.05；与对照组同时点同部位比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01

3讨论

髁突具有较强的生长改建能力，是整个下颌骨生长发育的中心。髁突软骨位于髁突表面，是一种特殊形式的结缔组织，不含血管、淋巴管及神经纤维。髁突软骨是直接接触关节盘的部位，因而其改建直接反映了外力对髁突的影响。覆盖于下颌髁突关节表面的纤维软骨，是髁突改建能力的基础，研究表明颞颌关节具有终生改建能力, 尤其是在幼年期及青少年改建能力较强。髁突的改建易受环境因素影响，张红梅等通过升高后牙咬合，增加了垂直向的距离，改变了下颌的位置，从而改变了髁突的位置及负荷，髁突进行了适应性改建。髁突的生长过程即为软骨细胞不断分化成熟的软骨内骨化过程，BMP-2在软骨细胞分化过程中起着重要的诱导作用。有研究报道在小鼠ATDC 5细胞系中，BMP-2可以通过诱导细胞跳跃早期细胞的聚集阶段而直接促进软骨的形成。体内外实验研究都已证实BMP-2可以诱导软骨细胞的增殖和分化，促进软骨细胞胞外基质的合成和维持。

在本研究中，实验组大鼠下颌后髁突软骨BMP-2的表达在第7、14、28天强于对照组，特别是在增殖层，同时在初期伴有该层的增厚，提示BMP-2在促进未分化的细胞向前软骨细胞的分化过程中起着重要作用，大量的未分化细胞分化成前软骨细胞，从而为软骨成熟提供足够的细胞来源；同时BMP-2在过渡层和肥大层表达的增强说明下颌前导加快了软骨细胞成熟，促进了髁突软骨的增生，提示BMP-2可能参与了下颌骨髁状突骨改建过程。实验组BMP-2表达第28天时较第14天时减少可能是局部组织改建已逐渐适应了外界力的刺激所致。赵志河等的研究结果显示髁突软骨表面的前部为压应力集中区，后上部则为张力区，髁突发生向前向下的位移，认为前伸下颌能促进下颌髁突的生长，与本实验结果相符。本研究实验组在同一时间点BMP-2表达在髁突后部要强于前部和中部，提示BMP-2的表达可能与下颌前导后髁突不同部位所产生的应力不同有关。综上，BMP-2可能参与了下颌骨髁状突骨改建过程，但对不同部位软骨的改建可能不同。

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(2016-02-15收稿，2016-04-07修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

The Expression of BMP-2 in the Condyle of Rat during Mandibular Advancement

QIN Bo, RUN Dan, XU Weihua

(DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedStomatologyHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang, 550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in the condylar cartilage of rats during mandibular advancement. Method: Forty 35-day-old male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into experimental group and control group. In experimental group the rats were treated with self-made functional appliance which caused mandibular protrusion while in control group the rats received no treatment. 5 rats in each group were sacrificed on the day 3, 7, 14 and 28 after experiment respectively. The expressions of BMP-2 in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage were examined by immunohistochemical staining. Results: With the observation time extended, the number of BMP-2 expression positive cells in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage in control group decreased gradually while the number of BMP-2 positive cells increased gradually, but the differences between two groups were not statistically significant(P>0.05). At different time points, the number of BMP-2 expression positive cells in posterior region was higher than that of anterior or middle region in experimental group (P<0.05). From 7th day, at the same time point, the number of BMP-2 expression positive cells in experiment group was significantly higher than that of control group (P<0.05).Conclusions: BMP-2 may participate in the remodeling activities of condylar cartilage. Its effect on mandibular cartilage remodeling may be different in different region of condyle cartilage.

[Key words]condyle cartilage; mandibular advancement; bone morphogenetic protein 2; immunohistochemical staining; rats, Sprague-Dawley

*通信作者E-mail:29574748@qq.com

[中图分类号]R783.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0570-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.019

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2013.004.html