PI3K/Akt信号通路对气腹预处理大鼠肝脏的保护作用*

蒋天盛， 李春来， 袁洪涛

(贵阳市第一人民医院, 贵州 贵阳　550001)



PI3K/Akt信号通路对气腹预处理大鼠肝脏的保护作用*

蒋天盛， 李春来， 袁洪涛

(贵阳市第一人民医院, 贵州 贵阳550001)

[摘要]目的： 观察气腹预处理后大鼠肝组织中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的变化。方法： 健康SD大鼠30只，随机均分为假气腹组、气腹组和气腹预处理组；气腹组大鼠脐旁插入气腹针并连接SN/REF气腹机充入二氧化碳(CO2)建立气腹模型(腹压保持在15 mmHg，持续90 min后解除气腹)，气腹预处理组在建立气腹前先进行预处理(充气5 min，放气5 min，重复2次)，其余同气腹组；假气腹组大鼠脐旁插入气腹针但不充入CO2气体；实验结束后处死大鼠；取同一部位肝组织，采用Western Blot检测肝脏中Akt、p-Akt蛋白的表达，采用TUNEL法检测肝细胞凋亡。 结果： 与假气腹组比较，气腹组大鼠肝脏中Akt及p-Akt的表达显著减少，而肝细胞凋亡率则显著增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与气腹组比较，气腹预处理组大鼠肝脏中Akt及p-Akt的表达显著增高，而肝细胞凋亡率则明显较少，差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论： PI3K/Akt信号通路可能参与了气腹预处理对大鼠肝组织的保护作用。

[关键词]模型,动物； 气腹,人工； 预处理； 蛋白激酶B； 大鼠,Sprague-Dawley

近年来，腹腔镜手术过程中建立二氧化碳(CO2)气腹所导致的腹腔脏器病理生理改变及其对脏器功能的影响正日益引起关注[1]。CO2气腹自身的压力会造成腹腔脏器组织缺血损伤，气腹缺血预处理对提高组织缺血耐受性的作用虽受到重视，但其保护作用的具体机制尚不清楚[2]。磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是体内调节细胞生长、分化、凋亡的关键信号通路之一，PI3K可通过激活其下游效应分子Akt，抑制促凋亡蛋白Bad、Bax和caspase的形成，从而达到抑制细胞凋亡的目的[3-4]。本研究通过模拟临床腹腔镜手术的操作环境，通过建立CO2气腹及气腹预处理动物模型，初步探讨CO2气腹预处理对大鼠肝组织中PI3K/Akt信号通路的影响及其对肝组织的保护作用。

1材料与方法

1.1动物、仪器与试剂

健康成年雄性SD大鼠30只，8～12周龄体，质量220～260 g，购自贵州医科大学实验动物中心；SN/REF气腹机(美国Stryker公司)；戊巴比妥钠购自上海西塘生物科技有限公司；兔抗大鼠Akt、p-Akt抗体购自北京博奥森生物技术有限公司； PVDF膜及ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；十二烷基硫酸钠、甘氨酸、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷及过硫酸铵购自北京鼎国公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1分组及模型复制30只SD大鼠随机分为假气腹组、气腹组和气腹预处理组，每组各10只。采用1%戊巴比妥钠按40 mg/kg 体重腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定。脐周采用75%酒精消毒灭菌，参照文献[5]建立气腹模型。气腹组大鼠在脐旁插入气腹针并连接SN/REF气腹机充入CO2建立气腹动物模型，腹压维持在15 mmHg，持续90 min后解除气腹；气腹预处理组在建立气腹前先进行预处理(CO2充气5 min、腹压维持在15 mmHg、放气5 min，重复2次)后建立CO2气腹，方法同气腹组；假气腹组仅在脐旁插入针头但不充入CO2。手术结束后24 h(再灌注24 h后)处死大鼠，每只大鼠取相同部位肝组织于4%中性甲醛溶液中固定48 h，剩余肝组织储存在-80 ℃低温冰箱，统一进行Western Blot检测。

1.2.2肝组织Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达采用Western Blot法检测，取0.1 g肝组织提取总蛋白，经垂直电泳分离蛋白质后，采用全湿电转移进行转膜，将PVDF膜置于封闭缓冲液中2 h。洗膜缓冲液洗膜3次，将PVDF膜与一抗稀释液(Akt 1∶1 000，p-Akt 1∶500)4 ℃孵育过夜。次日用洗膜缓冲液洗膜3次，PVDF膜与二抗稀释液(1∶3 000)在室温下孵育1 h, 洗膜缓冲液洗膜3次。加入增强化学发光试剂，暗室中反应1 min后将PVDF膜迅速封入保鲜膜中，Kodak胶片进行显影、定影，并用清水冲洗晾干。

1.2.3肝细胞凋亡检测采用 TUNEL法检测肝细胞凋亡， 严格按照试剂盒说明书操作。

1.3统计学处理

2结果

2.1肝脏组织中Akt、p-Akt蛋白表达

各组大鼠肝脏组织中Akt、p-Akt蛋白表达如表1、图1所示，与假气腹组比较，气腹组大鼠肝组织中Akt、p-Akt的表达均显著减少(P<0.01)；与气腹组比较，气腹预处理组大鼠肝脏组织中Akt、p-Akt的表达均显著增加(P<0.05)。

2.2肝细胞凋亡

TUNEL法检测肝细胞凋亡结果如表1、图2所示，假气腹组大鼠肝脏内仅有少量肝细胞发生凋亡，而气腹组大鼠肝细胞凋亡率较假气腹组明显增加(P<0.01)；经气腹预处理组大鼠肝组织中细胞凋亡率较气腹组显著减少(P<0.05)。

表1　大鼠肝脏组织中总Akt、p-Akt水平及

(1)与假气腹组比较，P<0.01；(2)与气腹组比较，P<0.05

注：1 假气腹组; 2 气腹组; 3 气腹预处理组图1　3组大鼠肝脏组织中Akt、p-Akt表达(Western Blot)Fig.1　Expression of Akt and p-Akt in liver tissue of 3 groups of rats(Western Blot)

3讨论

腹腔镜手术过程中通常采用CO2气腹技术来获得充分的操作空间。在建立CO2气腹的过程中，由于腹腔压力快速增加，压迫内脏血管，使肝动脉、门静脉等血管阻力增加，血液灌流不足，从而导致肝脏的缺血损伤[6]；当手术结束解除气腹后由于腹腔内压骤降，内脏血管阻力消除，肝脏血液灌流得以恢复。因此气腹过程实质上相当于肝脏缺血再灌注过程，其所引起的肝脏损伤已被大量研究所证实[7]。近年来有研究表明，气腹预处理有类似缺血预处理的作用，能有效减轻腹腔镜术中气腹所致的肝脏损伤。Ates等[8]报道在建立大鼠CO2气腹前，给予5 min的充气(15 mmHg)和5 min的放气可显著改善术中长时间气腹产生的缺血/再灌注损伤。PI3k/Akt信号通路中的PI3K是生长因子受体超家族中的重要成员，而其下游效应分子Akt为PKA和PKC家族成员[9]。PI3k活化后使Akt转位到细胞膜，催化其自身的Ser124和Thr450发生磷酸化而激活；此外Akt和PDK-1同时定位在细胞膜上，PDK-1能进一步催化Akt的Ser473和Thr308发生磷酸化，从而使Akt完全活化[10]。磷酸化的Akt(p-Akt)可以传递抗凋亡信号到其下游的效应分子，从而发挥对抗细胞凋亡，促进细胞生长增殖的作用[11]。

假气腹组　　　　　　　　　　　气腹组　　　　　　　　　　　气腹预处理组图2　3组大鼠肝细胞凋亡(TUNEL，×200) Fig.2　Hepatocytes apoptosis of 3 groups of rats

本研究通过模拟临床腹腔镜手术的操作环境，建立CO2气腹及气腹预处理动物模型，观察各组大鼠肝脏组织中总Akt及p-Akt的表达情况。结果表明，气腹组大鼠肝组织中总Akt及p-Akt的表达较假气腹组显著减少，同时肝组织内细胞凋亡率显著增加，提示PI3K/Akt信号通路的抑制可能参与了CO2充气和放气造成的肝组织缺血/再灌注损伤。而气腹预处理组大鼠肝组织中总Akt及p-Akt的表达较气腹组明显增多，同时肝组织内细胞凋亡率较气腹组有所减少，这充分表明气腹预处理能通过激活PI3K/Akt信号通路减少肝细胞凋亡来发挥减轻肝组织缺血-再灌注损伤的作用。

4参考文献

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(2016-01-10收稿，2016-04-22修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Protective Effect of PI3K/Akt Signaling Pathway on Liver of Pneumoperitoneum Preconditioning Rats

JIANG Tiansheng, LI Chunlai, YUAN Hongtao

(TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the change of PI3K/Akt signaling pathway in liver tissue of pneumoperitoneum preconditioning rats. Methods: 30 healthy SD rats were divided into sham pneumoperitoneum group, pneumoperitoneum group and pneumoperitoneum preconditioning group randomly, 10 rats in each group. Inserting the veress beside the navel of rats and connecting SN/REF pneumoperitoneum machine to insufflate CO2 for 90 minutes to establish the pneumoperitoneum model, abdominal pressure maintained at 15 mmHg. The pneumoperitoneum preconditioning group was subjected to 5 min of insufflation and 5 min of deflation, repeat for 2 times, then following the same practice as pneumoperitoneum group. The rats of sham pneumoperitoneum group were inserted needles but not filling CO2. Changes of PI3K/Akt signaling pathway were detected by western blot. The apoptosis of hepatocytes was detected by TUNEL. Results: Comparing with sham pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum group were significantly decreased(P<0.01), while the apoptosis of hepatocytes was increased; comparing with pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum preconditioning group were significantly increased(P<0.05), while the apoptosis of hepatocytes was decreased. Conclusion: PI3K/Akt signaling pathway may be involved in the protective effects of pneumoperitoneum preconditioning on liver tissue of rats.

[Key words]model,animal; pneumoperitoneum,artificial; preconditioning; protein kinase B; rats,Sprague-Dawley

*[基金项目]贵阳市卫生局科学技术计划项目[(2014)筑卫科技合同字第2号]

[中图分类号]R657.3

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0564-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.017

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2115.040.html