NDY1 shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达*

卢芳芳，况　燕，徐朝欢，王　旗，李美仪

(广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁 530021)



NDY1 shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达*

卢芳芳，况燕△，徐朝欢，王旗，李美仪

(广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁 530021)

[摘要]目的构建NDY1 shRNA真核表达载体，并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据GenBank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列，设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA(shRNA)序列，插入表达载体获得重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后，脂质体介导转染A2780细胞，经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞，采用实时定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确，转染shNDY1后，A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降(72.89±4.83)%及(55.85±4.84)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建pGPU6/GFP/Neo-shNDY1真核表达质粒，并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞，为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。

[关键词]卵巢肿瘤；NDY1；质粒构建；A2780细胞

组蛋白去甲基化酶NDY1(not dead yet-1,NDY1)是一种重要的表观调控因子。它属于包含JmjC 结构域的组蛋白去甲基化酶(JmjC domain-containing histone demethylase，JHDM)家族成员,能够特异性催化H3K36me2和H3K4me3脱甲基[1]，并在细胞增殖，细胞周期，干细胞自我更新及肿瘤转化等过程中发挥重要调节功能[1-3]。NDY1异常表达可促使细胞增殖失控，导致肿瘤表型表达。研究发现，在胰腺癌、乳腺癌、急性白血病等恶性肿瘤中NDY1高表达，并与肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、临床预后密切相关[4-6]。对鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的研究表明，NDY1通过逆转microRNA let-7b对癌基因EZH2 mRNA的转录后抑制，诱导MEFs永生化。目前已有研究提示NDY1具有促癌功能，而NDY1与卵巢癌的关系则未见报道。为探明二者的关系，本研究构建表达NDY1 shRNA的真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-shNDY1，转染卵巢癌A2780细胞后获得稳定转染细胞株，从而为进一步研究NDY1和卵巢癌的关系奠定实验基础。

1材料与方法

1.1材料人上皮性卵巢癌细胞A2780获赠于华中科技大学同济医学院附属协和医院妇瘤实验室。质粒载体pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛公司，质粒中量抽提试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司，DNA内切酶(BpiⅠ、PstⅠ、BamHⅠ)、DNA连接酶及DNA mark均购自Fermentas公司，DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，LipofectamineTM2000、G418购自Invitrogen公司，RNA提取试剂盒购自Axygen公司，逆转录试剂盒购自Takara公司，SYBR Green Real Time PCR Master Mix购自Roche公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，细胞质蛋白及核蛋白抽提试剂盒购自碧云天公司，兔抗人NDY1多克隆抗体购自Millipore公司，兔抗人LaminB1抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自CST公司，引物由Takara公司合成。

1.2方法

1.2.1NDY1 shRNA序列的设计及合成根据GenBank提供的NDY1基因序列(序列号：NM_032590.4)，由上海吉玛公司设计并合成针对NDY1 的特异性RNAi序列，NDY1-S:5′-CAC CGG GCA AAG ATT TCA ACT ATG ATT CAA GAG ATC ATA GTT GAA ATC TTT GCC CTT TTT TG-3′;NDY1-AS:5′-GAT CCA AAA AAG GGC AAA GAT TTC AAC TAT GAT CTC TTG AAT CAT AGT TGA AAT CTT TGC CC-3′；相应阴性对照(nagtive control,NC)序列如下，NC-S:5′-CAC CGT TCT CCG AAC GTG TCA CGT CAA GAG ATT ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT TTT TG-3′,NC-AS:5′-GAT CCA AAA AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT AAT CTC TTG ACG TGA CAG TTC GGA GAA C-3′。

1.2.2pGPU6/GFP/Neo-NDY1质粒的构建及鉴定在PCR仪上进行NDY1 shRNA单链退火反应，反应条件为：95 ℃ 5 min;85 ℃ 5 min;75 ℃ 5 min;70 ℃ 5 min。退火处理后得到NDY1 shRNA 模板用于连接反应。将pGPU6/GFP/Neo载体用BpiI、BamHI 37 ℃酶切1 h，琼脂糖电泳估算浓度并回收。在连接反应体系中加入线性化的载体及NDY1 shRNA 模板，T4连接酶22 ℃反应1 h，用于构建pGPU6/GFP/Neo-NDY1真核表达质粒。连接产物转化感受态Top10细菌，取 200 μL转化后的细胞涂布于含 50 μg/mL卡那霉素的LB 平板上，37 ℃培养16 h，从每块平板上挑取5个菌落，接种到含 50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇床振摇16 h；使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamHⅠ,PstⅠ分别酶切鉴定，挑选两个酶切结果正确的质粒送至上海英骏公司测序。

1.2.3卵巢癌A2780细胞株的稳定转染选择处于对数生长期的A2780细胞，以每孔1.5×105个细胞接种于24孔板中，每孔添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基500 μL，并置于37 ℃ 含5% CO2的恒温培养箱中培养。24 h后待细胞汇合度达到80%～90%，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将pGPU6/GFP/Neo-shNDY1质粒转染A2780细胞，同时转染pGPU6/GFP/Neo-shNC作为阴性对照，以未转染A2780作为空白对照。转染24 h后，细胞以1∶10比例传代并接种于另一块24孔板，次日加入终浓度为300 μg/mL的G418进行筛选。2周后用有限稀释法挑取单个阳性克隆细胞接种于96孔板，待其长满后逐渐传入24孔板，6孔板、最后移入培养瓶中扩大培养。

1.2.4RT-qPCR检测NDY1 mRNA的相对表达采用Axygen公司RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，按照Takara逆转录试剂盒说明书合成相应cDNA，用于定量PCR的NDY1引物序列如下，上游引物：5′-CTC ACT GCT GTT GGC ACC AC-3′，下游引物：5′-TGC TTG CAG TAC CTC AGG TCA ATA-3′；以β-actin作为内参，上游引物序列：5′-CAG GCA CCA GGG CGT GAT-3′，下游引物序列：5′-TAG CAA CGT ACA TGG CTG GG-3′，扩增反应在ABI 7300荧光定量PCR仪上完成。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环，反应结束后用2-△△Ct法计算各组细胞NDY1/β-actin比值，本实验重复3次。

1.2.5Western blot 检测NDY1蛋白表达试剂盒法提取细胞核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品煮沸变性5 min，取20 μg核蛋白置于含10%分离胶的SDS-PAGE中电泳；随后200 mA，2 h转移至PVDF膜，5%BSA封闭液封闭2 h；加入兔抗人NDY1一抗(1∶500)及兔抗人LaminB1(1∶10 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗兔荧光二抗(1∶8 000)避光孵育1 h，TBST洗膜3次，采用Odyssey红外荧光扫描系统识别并拍照；本实验重复3次。

1.3统计学处理采用SPSS13.0软件对数据进行统计学处理，多组间的均值比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SLD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1pGPU6/GFP/Neo-shNDY1真核表达质粒的鉴定如图1所示，分别用DNA内切酶PstⅠ、BamHⅠ酶切鉴定重组质粒，经PstⅠ处理后质粒不能被切开；经BamHⅠ酶切后，在5 175 bp处出现条带；结果表明：合成目的片段正确插入pGPU6/GFP/Neo载体预期位点。经上海英骏公司测序结果证实质粒测序结果正确，pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1真核表达质粒构建成功(图2)。

M：Lamda/Eco130I DNA Marker；1(a)、2(a)：pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1质粒1，2的PstⅠ酶切鉴定结果；1(b)、2(b)：pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1质粒1，2的BamHⅠ 酶切鉴定结果。

图1pGPU6/GFP/Neo-shNDY1酶切鉴定结果

图2　pGPU6/GFP/Neo-shNDY1质粒测序图谱

2.2shNDY1稳定转染的A2780细胞株筛选重组质粒转染24 h后，荧光显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的A2780细胞；经扩大培养以及G418筛选2周后，显微镜下可见阳性克隆细胞团形成，转染效率达90%(图3)。

A：shNDY1-A2780细胞荧光源成像；B：shNDY1-A2780细胞普通光源成像；C：shNC-A2780细胞荧光源成像；D：shNC-A2780细胞普通光源成像。

图3pGPU6/GFP/Neo-shNDY1在稳定转染的A2780细胞中的表达(×100)

2.3A2780细胞NDY1 mRNA的相对表达RT-qPCR结果显示，以未转染的A2780细胞NDY1 mRNA表达水平为100%，shNDY1-A2780细胞mRNA表达水平较未转染组下降(72.89±4.83)%(P=0.001)，较shNC组亦有明显下调(P=0.001)；而与未转染组细胞相比，shNC组NDY1 mRNA相对表达量下降约(5.34±8.79)%，二者差异无统计学意义(P>0.05)，表明所构建的质粒能明显抑制A2780细胞NDY1 mRNA表达(图4)。

图4　RT-qPCR检测各组细胞NDY1 mRNA表达情况

2.4A2780细胞NDY1蛋白表达变化以未转染A2780细胞的NDY1蛋白表达水平为100%，shNDY1-A2780细胞的NDY1蛋白表达下调(55.85±4.84)%(P=0.027)，与shNC-A2780组相比亦有明显下调，差异有统计学意义；而shNC-A2780组蛋白表达水平为(111.20±2.84)%,与未转染组相比差异无统计学意义(P=0.581)。表明重组质粒转染后，能有效降低NDY1蛋白表达(图5)。

图5　Western blot检测各组细胞NDY1蛋白表达情况

3讨论

表观遗传学是近年肿瘤研究领域的研究热点，其包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰、非编码RNA在内的多种调控形式。研究表明，表观遗传机制参与细胞增殖、细胞凋亡、干细胞更新以及肿瘤耐药等多种生理病理过程[7-10]。Rebbani等[11]发现，肝细胞癌组织中抑癌基因位点DNA甲基化异常增加；对卵巢癌的研究证实，miR-130a、miR-374a在卵巢癌耐药细胞中高表达，并通过调节MDR1 进而影响细胞耐药性[12]。

NDY1是一种重要的表观调控因子，其编码产物包含具有去甲基化酶活性的JmjC结构域，通过催化组蛋白H3K36me2和H3K4me3去甲基化进而影响靶基因转录过程[1,3-4]。现已证实，NDY1在胰腺癌、乳腺癌、急性髓细胞白血病中呈现高表达，影响肿瘤的发生发展，因此被认为是一种促癌基因[4-6]。研究发现，NDY1通过下调p15Ink4b加速细胞周期进程，促进鼠胚胎成纤维(MEF)细胞增殖[13]。骨髓细胞NDY1上调能诱导Nsg2表达，干扰幼稚造血细胞的发育成熟，促进髓系及B淋巴细胞白血病的发生[14-15]。在胰腺癌中，过表达的NDY1与KrasG12D协同促进肿瘤的进程，且NDY1的表达水平与肿瘤分级、分期及远处转移密切相关；而沉默NDY1表达则能逆转胰腺癌细胞的致瘤性[4]，提示NDY1可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。

尽管已有研究表明NDY1的异常表达可以影响肿瘤的发生发展，但NDY1和卵巢癌的关系却尚未见报道。为了探索NDY1对卵巢癌发病的影响，寻找临床治疗卵巢癌的新靶点，本研究构建表达shNDY1的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-shNDY1，经酶切鉴定及DNA测序检测证实目的质粒构建成功。脂质体法将目的质粒导入卵巢癌细胞A2780，经 G418加压筛选成功获得稳定表达shNDY1的阳性单克隆；RT-qPCR检测转染后NDY1 mRNA的抑制率达(72.89±4.83)%，其相应蛋白表达亦明显下调。

综上所述，本研究构建的真核表达载体能够成功抑制卵巢癌细胞内源性NDY1基因表达，并在细胞水平为研究NDY1与卵巢癌的关系以及探索以NDY1为治疗靶点的卵巢癌临床治疗新方法奠定实验基础。

参考文献

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Construction of NDY1 shRNA eukaryotic expression plasmid and its stable expression in ovarian cancer cell line A2780*

Lu Fangfang,Kuang Yan△,Xu Chaohuan,Wang Qi,Li Meiyi

(Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning，Guangxi 530021,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct NDY1 shRNA eukaryotic expression plasmid and to obtain shNDY1-stably expressed ovarian cancer cell line A2780 cell.MethodsBased on the NDY1 gene nucleotide sequence provided by GenBank database,a short hairpin RNA (shRNA) targeted NDY1 gene was designed and synthesised,and the expression vector was inserted for obtaining recombination plasmid pGPU6/GFP/Neo-shNDY1.After identification by sequencing,then liposome mediated transfection to A2780 cell was conducted,stable transfected cells were obtained through G418 selection and limited dilution.NDY1 mRNA and protein expression level were detected by the real time quantitive RT-qPCR and Western blot,respectively.ResultsThe sequencing of recombinant plasmid was correct.After shNDY1transfection,mRNA and protein expression level of A2780 cells were decreased by(72.89±4.83)% and (55.85±4.84)%,the difference in the comparison with the control group was statistically significant.ConclusionEukaryotic expression plasmid pGPU6/GFP/Neo-shNDY1 is successfully constructed,and the stably transfected A2780 cell line is obtained,which lays the foundation for studying the relation of NDY1 ovarian cancer in cellular level.

[Key words]ovarian neoplasms;NDY1;plasmid construction;A2780 cell

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.002

* 基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360389)；广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFAA053086)；广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题资助项目(Z2013026)；2013年广西研究生教育创新计划资助项目(YCSZ2014101)。

作者简介：卢芳芳(1990-)，在读硕士，主要从事妇科肿瘤方面的研究。△通讯作者,E-mail:kuangyan2004@sina.com。

[中图分类号]R737.31

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)08-1012-04

(收稿日期：2015-10-19修回日期：2015-12-10)