不同剂量rhEPO对新型支气管肺发育不良大鼠肺eNOS和Bcl-2蛋白表达的影响*

王冰冰，张　华

(桂林医学院附属医院新生儿科，广西桂林 541004)



不同剂量rhEPO对新型支气管肺发育不良大鼠肺eNOS和Bcl-2蛋白表达的影响*

王冰冰，张华△

(桂林医学院附属医院新生儿科，广西桂林 541004)

[摘要]目的观察使用不同治疗剂量的重组人促红细胞生成素(rhEPO)对SD新生幼鼠的新型支气管肺发育不良(BPD)模型中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、Bcl-2在肺组织的表达水平变化的影响，并找出合适的给药时间及使用剂量，旨在探讨其对新型BPD的保护作用。方法利用脂多糖(LPS)和持续高氧制备新型BPD模型。选取未作任何处理的正常新生幼鼠18只作为空气对照组，然后将90只新生BPD模型幼鼠分为生理盐水对照组(A组)、rhEPO800组(B组)、rhEPO1000组(C组)、rhEPO1200组(D组)、rhEPO1400组(E组)，各18只，在给药后第1、7、14天从各组抽取6只处死并取下肺组织于液氮保存。采用RT-PCR及Western blot 法检测SD新生幼鼠肺组织中eNOS、Bcl-2蛋白及mRNA水平的表达情况。结果A组中Bcl-2蛋白及mRNA表达水平比空气对照组明显降低，而eNOS的表达水平明显升高；B、C、D、E组与A组相比，随着rhEPO浓度的升高，Bcl-2蛋白和mRNA的表达水平逐渐升高，而eNOS的表达量逐渐降低，E组中的表达变化最为明显，且差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhEPO对新型BPD具有一定的治疗作用，而且连续使用1 400 IU/kg rhEPO 14 d，治疗效果最好。

[关键词]重组人促红细胞生成素；支气管肺发育不良；Bcl-2；内皮型一氧化氮合酶；疗效；剂量

在早产儿呼吸系统疾病中，支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BDP)是常见病之一，有研究发现其与宫内炎性感染[1-3]及生后高氧辅助通气等原因有关，存活患儿常会出现反复的呼吸道感染，严重影响患儿的生存质量。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)被认为是与促进骨髓组织造血功能有关，同时还具有抑制凋亡、促进损伤组织的修复等作用[4]。本实验拟探讨在不同浓度rhEPO的干预下，生前宫内炎性感染，生后又高氧暴露的新生SD幼鼠肺组织中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和Bcl-2蛋白和mRNA表达的影响。并找出合适的给药时间及剂量，为能够在临床上应用rhEPO防治BPD提供理论及实验基础，进一步为BPD临床防治开辟新思路。

1材料与方法

1.1实验材料Spraque-Dawley(SD)雌鼠60只(200～250 g),雄鼠30只(250～300 g)，购自广西医科大学实验动物中心(合格证号:SCXK桂2009-0002)；rhEPO购自协和发酵麒麟株式会社，脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，WIP裂解液购自北京博奥森生物技术有限公司，超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天公司)，eNOS一抗兔抗(Affinity公司)，Bcl-2一抗兔抗、β-actin一抗鼠抗(博士德生物工程有限公司)，二抗兔抗及鼠抗购自中杉金桥，β-actin、Bcl-2、eNOS引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，总RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒、cDNA扩增试剂盒均购自康为世纪公司，微量加样器，钠石灰，无水氯化钙。引物序列如下：β-actin上游引物5′-GTC CCT GTA TGC CTC TGG TC-3′，下游引物5′-ACC GCT CAT TGC CGA TAG T-3′(344 bp)；Bcl-2上游引物5′-TTT CTC CTG GCT GTC TCT GAA-3′，下游引物5′-TGT GTG TGT GTG TGT TCT GCT-3′(217 bp)；eNOS上游引物5′-AGA CGG ACC CAA GTT TCC TC-3′，下游引物5′-TCC CGA GCA TCA AAT ACC TG-3′(411 bp)。

1.2实验方法

1.2.1模型制备使用随机数字表法将雌雄鼠按2∶1合笼交配，第2天早晨观察雌鼠阴道口处的阴栓或用棉棒蘸取雌鼠阴道分泌物涂片，镜检观察。如观察到精子，把该日记为妊娠第1天。在孕鼠怀孕的70%胎龄时，即第15天，注射10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉，沿腹中线处切开，将5 μL/孕囊的LPS(30 ng/mL)注射到每1个孕囊内。待新生幼鼠产出后，将其随机分为以下5组，每组18只。生理盐水对照组(A组)、rhEPO800组(B组)、rhEPO1000组(C组)、rhEPO1200组(D组)、rhEPO1400组(E组)；将新生幼鼠置于氧浓度维持在60%的高氧舱中，并放置无水氯化钙和钠石灰吸收CO2及H2O，以高氧暴露为第1天，按随机数字表法分组后，隔天分别由背部皮下注射相应的rhEPO或生理盐水。每天开箱2 h，每日更换垫料及与正常组调换母鼠，保持环境干燥清洁，减少幼鼠死亡率。空气对照组18只，从未做任何处理母鼠所产的新生幼鼠中随机抽取。本实验的造模方法参考的是本课题组前期的实验方法[5]。

1.2.2标本采集分别在实验的第1、7、14天末每组选取6只，水合氯醛麻醉后，迅速开胸取下肺组织置于2 mL组织管里，液氮速冻后放入-80 ℃冰箱保存，已备下一步实验使用。

1.2.3RT-PCR检测Bcl-2、eNOS mRNA的表达使用180 ℃高温干烤6 h后冷却至室温的研钵，在液氮低温环境下将肺组织研磨为淡粉色粉末，转移至提前备好的含有1 mL RNA裂解液的1.5 mL EP管中，根据所购买的提取RNA试剂盒说明书步骤操作提出总RNA。观察RNA 28 s、18 s的表达，检测总RNA的完整性，根据生物分光光度计测的总RNA浓度，配制逆转录反应体系，获取cDNA，进行PCR扩增反应(eNOS条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s,60.1℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环，上样量10 μL；Bcl-2条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s,57.2 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,32个循环，上样量5 μL。使用launch SensiAnsys软件测定条带的光密度，重复以上操作3次。

1.2.4Bcl-2和eNOS蛋白Western blot半定量检测用研钵把肺组织在液氮低温下磨碎， 加入含有WIP裂解液和PMSF的EP管中，充分裂解离心后，提取含蛋白的上清液，于-80 ℃保存，分装少量用于测定蛋白浓度。根据所得的数据配制等体积、等质量、等密度的上样品，根据Bcl-2和eNOS蛋白的分子量配制相应的聚丙烯酰胺凝胶，分别使用半干式和湿式电转，将蛋白转到PVDF膜上，室温下封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)封闭90 min，孵相对应的Bcl-2一抗(1∶200稀释)和eNOS一抗(1∶250稀释)，4 ℃摇床过夜，TBST漂洗3次，每次10 min，然后孵兔抗按1∶5 000稀释,90 min后漂洗3次后，滴加发光液，使用BIO-RAD凝胶成像系统拍照，曝光时间10～30 s，拍摄图片，使用launch SensiAnsys软件测取灰度值分析，每份组织至少重复4次，用β-actin作内参以示比较。

1.3统计学处理所有数据使用SPSS18.0统计软件进行分析。该实验数据为计量资料，组间数据采用单因素ANOVA方差分析，使用LSD-t检验进行组内两两比较，检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RT-PCR检测Bcl-2、eNOS mRNA的表达新生幼鼠肺组织中β-actin 、Bcl-2和eNOS PCR引物扩增产物长度分别为344、217和411 bp，与引物设计相符，见图1、2。在第1、7、14天A组与空气对照组比较，Bcl-2的mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；D、E组与A组比较，Bcl-2的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)；在第7天，C组Bcl-2的mRNA表达量高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。在第1、7、14天，A组与其他组相比，eNOS的mRNA表达量均上调，差异有统计学意义(P<0.05)；在第1、7天，E组与B、C、D组相比，eNOS的mRNA表达量均低于其他组，差异有统计学意义(P<0.05)；在第7天，B组与C、D两组相比，eNOS的mRNA表达量均高于其他组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

1：DNA Marker；2：A组；3：空气对照组；4：B组；5：C组；6：D组；7：E组。

图1各组肺组织eNOS mRNA的表达

1：DNA Marker；2：A组；3：空气对照组；4：B组；5：C组；6：D组；7：E组。

图2各组肺组织Bcl-2 mRNA的表达

2.2Bcl-2和eNOS蛋白表达新生幼鼠肺组织中Bcl-2、eNOS、β-actin蛋白相对分子质量为26×103、140×103、43×103，见图5。在第1、7、14天，A组与空气对照组比较，Bcl-2的表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)；在第7天，E组Bcl-2的蛋白表达量均高于B、C、D组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组与B组相比，Bcl-2的蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；在第14天E组Bcl-2的蛋白表达量均高于A、B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)。在第1、7、14天，A组与空气对照组比较，eNOS的蛋白表达量明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)；在第1天，E组与A组相比，eNOS的蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；在第7天，E组与A、B、C组相比，eNOS的蛋白表达均低于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组与A组、B组相比，C组与A组、B组相比，eNOS的蛋白表达量均低于其他2组，差异有统计学意义 (P<0.05)；在第14天，A组与B、C、D、E组相比，eNOS的蛋白表达水平均高于其他4组，差异有统计学意义(P<0.05)；而E组和B组相比，eNOS的蛋白表达量低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6、7。

*：P<0.05，与A组比较。

图3各组肺组织中Bcl-2 mRNA的表达

*：P<0.05，与A组比较；▲：P<0.05，与B组比较；△：P<0.05，与E组比较。

图4各组肺组织中eNOS mRNA的表达

1：A组；2：空气对照组；3：B组；4：C组；5：D组；6：E组。

图5各组肺组织eNOS和Bcl-2的蛋白表达

*：P<0.05，与A组比较；▲：P<0.05，与B组比较；△：P<0.05，与E组比较。

图6各组肺组织中Bcl-2蛋白的表达

*：P<0.05，与A组比较；▲：P<0.05，与B组比较；△：P<0.05，与E组比较。

图7各组肺组织中eNOS蛋白的表达

3讨论

出生体质量小于1 kg,胎龄不足28周的极不成熟儿或超低出生体质量儿被称作新型BPD患儿，它的主要特征是肺部的微血管发育不良，细微结构发育异常。Klinger等[6]报道胎龄24～25周BPD发生率为50.1%，而随着胎龄的增加，发病率逐渐降低。有研究表明宫内感染造成的绒毛膜羊膜炎[2-3]及患儿出生后由于肺功能发育不全，需辅助吸入高氧，可引起肺组织的炎症性瀑布式反应，产生过多的氧自由基，从而导致肺泡呼吸膜破坏，和炎症因子过度浸润，最终导致肺组织结构异常。因此，可认为这两种因素是新型 BPD发生的机制之一。而在具体因子方面有学者则发现高氧环境下内质网应激(ZGU) 相关蛋白GRP78、caspase-12，Smo 和Glil蛋白的表达增加[7-8]也恰恰证明了这一点。

Bcl-2和eNOS是Ang/Tie 通路[9-10]下游的PI3K/AKT信号传导通路被激活后的效应因子。目前Bcl-2在众多文献被广泛认为是PI3K/AKT信号传导通路激活的标志分子，在众多器官中都有表达。它被激活后能够促进内皮细胞增殖、迁移，抑制凋亡，促进内皮细胞与其他细胞之间的相互作用，最终促进新生血管生成。而eNOS在正常情况下表达可产生少量具有信号传导作用的NO,在对抗肺损伤中有保护内皮的屏障功能、减少黏附分子(VCAM)的表达和阻止中性粒细胞迁移的作用。

查看国内外的研究发现，糖蛋白EPO对于动物及人体的多处组织器官如肾、脑、眼等，具有延缓感染、延缓氧化、对抗凋亡，促进损伤的血管生成，促进损伤组织的修复等作用[3,11-12]。由此推论rhEPO能够在一定程度上减轻感染加高氧对肺组织的损伤。而本研究实验结果显示：注射rhEPO后，肺组织Bcl-2和eNOS的表达随着用药时间的推移，出现了相应的变化，用药14d后各自表达量接近在正常肺组织中的表达，结合课题组前期的研究[5，13-14]，通过肺部切片的HE染色观察，使用rhEPO能够减轻肺损伤的病理改变。而国外研究也表明，EPO对于肺部的炎症在治疗与正常组相比，能够显著减少肺泡出血，减少中性粒细胞和肥大细胞的浸润,降低肺泡壁厚度。由此说明rhEPO能够对新型BPD的发展进行干预，促进损伤肺组织的修复。而且在本实验过程中通过比较发现Bcl-2与eNOS在肺组织中整体表达水平，eNOS的表达量要比Bcl-2低很多，由此推测Bcl-2修复肺细胞的作用更重要一些。而且根据第1、7、14天不同用药时间及用药剂量的比较，间隔使用1400IU的rhEPO14d，对在肺组织的修复

作用最明显。结合与Rayjada等[15]在临床方面使用rhEPO对治疗早产儿BPD研究结果，在推测rhEPO作用Ang/Tie 通路下游的PI3K/AKT信号传导通路，可以有效地减轻新型BPD的肺组织的损伤程度，提前预防和治疗对提高患儿今后的生活质量具有重要的意义。

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The influence of different doses of rhEPO to the expression of new BPD rat lung eNOS and the Bcl-2 protein*

Wang Bingbing,Zhang Hua△

(Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin，Guangxi 541004,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe changes of the expression of Bcl-2 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in lung tissue,which was used the indifferent treatment doses of recombinant human erythropoietin (rhEPO) of newborn SD model of a new type of bronchial pulmonary dysplasia.To explore its effect on the protection of the new type of bronchial pulmonary dysplasia(BPD),and find out the appropriate drug delivery time and dosage.MethodsWe used the things lipopolysaccharide (LPS) and continuous high oxygen preparation to make the new model of the BPD.We made random normal newborn mice 18 as normal air group,and then 90 newborn baby mice model of random points normal saline group (group A),rhEPO800 group (group B);rhEPO1000 group (group C),rhEPO1200 group (group D),rhEPO1400 group (group E),in experiment 1,7,and 14 days,we were randomly selected 6 executed only lung tissue under liquid nitrogen.Using RT-PCR and Western blot method to detect the Bcl-2 and eNOS protein and mRNA expression in lung tissue.ResultsCompared with the normal air group,the expression of protein and mRNA of Bcl-2 in group A was decreased,while the expression of eNOS was increased.Compared with group B,C,D,E,with the increase of rhEPO concentration,the expression of Bcl-2 protein and mRNA in group A gradually increased,while the expression of eNOS gradually decreased,and the expression of the group E was the most obvious,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionIt is prompted that rhEPO has some treatment function to the new BPD,while the dose of 1 400 IU/kg of 14 days have the best function.

[Key words]rhEPO;bronchial pulmonary dysplasia;Bcl-2;endothelial nitric oxide synthase,;treatment effect;dose

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.012

* 基金项目：广西医疗卫生重点科研课题(重2011011)。

作者简介：王冰冰(1989-),医师，硕士，主要从事围产新生儿方向研究。△通讯作者， E-mail：zh4205@163.com。

[中图分类号]R722.19

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)11-1481-03

(收稿日期：2015-11-20修回日期：2015-12-17)