SpA刺激单核巨噬细胞表达早期致炎因子的实验研究*

马兴龙,黄俞霖,陈晓晴,李明强,刘清蒙△

(1.遵义医学院第三附属医院重症医学科，贵州遵义 563002；2.遵义医学院2011级检验专业本科生，贵州遵义 563099；3.遵义医学院微生物教研室，贵州遵义 563099)



SpA刺激单核巨噬细胞表达早期致炎因子的实验研究*

马兴龙1,黄俞霖2,陈晓晴2,李明强3,刘清蒙3△

(1.遵义医学院第三附属医院重症医学科，贵州遵义 563002；2.遵义医学院2011级检验专业本科生，贵州遵义 563099；3.遵义医学院微生物教研室，贵州遵义 563099)

[摘要]目的探讨金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)对单核巨噬细胞表达早期致炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的影响。方法用一定浓度SpA与THP-1细胞培养不同时间，用MTT法测定SpA对THP-1细胞增殖的影响；用ELISA 测定培养液中TNF-α、IL-1和IL-6的水平；用RT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1和IL-6相应mRNA的表达，并对结果进行统计学分析。结果SpA对THP-1细胞增殖的影响与其作用剂量有关。SpA可促进巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1和IL-6及表达相应mRNA，且呈一定剂量-效应和时间-效应关系。SpA刺激巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6和表达相应mRNA 均在12 h达高峰。SpA刺激组TNF-α、IL-1和IL-6 的表达和释放均显著升高(P<0.01)。结论SpA可明显促进单核巨噬细胞表达和分泌早期致炎细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。SpA在启动金葡菌性脓毒症及促进其发展中，具有不可忽视的作用。

[关键词]金黄色葡萄球菌蛋白A；THP-1；肿瘤坏死因子；白细胞介素-1；白细胞介素-6

脓毒症(Sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征。进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。MODS是导致脓毒症患者多器官衰竭和死亡的主要原因，其发生率在世界范围内仍然呈上升趋势，病死率依然居高不下[1-2]。全球发起拯救脓毒症运动(surviving sepsis campaign，SSC)，以及SSC指南希望能提高脓毒症的抢救成功率[3]。

鉴于MODS发病特点是继发性、顺序性和进行性，一旦启动，必然按一定顺序进行，因此，启动脓毒症的早期致炎细胞因子备受基础和临床研究者重视[4-7]。单核巨噬细胞(macrophage,Mф)在抗感染免疫应答过程中可产生多种细胞因子和(或)诱导炎症的致炎因子，特别是早期致炎细胞因子[8-9]。Mф在脓毒症的发生和发展中具有重要的作用。

近年，耐药金葡菌性脓毒症明显增加，对临床防治增加了巨大难度[10-11]。金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)是金葡菌细胞表面抗原，可刺激多种免疫细胞活化，分泌活性细胞因子，包括巨噬细胞分泌致炎细胞因子。文献显示[12]，SpA与肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)结合，发挥TNF样作用，启动TNF信号级联放大反应，发挥促炎效应。本文就SpA刺激对Mф表达早期致炎细胞因子的影响进行了初步探讨。

1材料与方法

1.1材料人Mф株。按本室常规将THP-1细胞株放入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，接种24孔培养板，每孔1 mL，加入 PMA(终浓度100 ng/mL)，培养24 h后，贴壁细胞即为Mф。台盼兰染色活细胞数大于95% 。

1.2方法

1.2.1SpA的制备标准金黄色葡萄球菌菌株(S1800)由本室保存，按本室常规制备粗提SpA,并与购买纯化SpA比较，实验效果相一致。本实验均采用自提SpA。

1.2.2THP-1细胞增殖的测定取对数生长期细胞，调整细胞浓度为 1×105/mL，接种96孔培养板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培养12 h；加入不同浓度SpA，孵育24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。1 000 r/min，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床低速振荡10 min，酶联免疫检测仪OD490nm测量吸光值。

1.2.3TNF-α、IL-1和IL-6的测定用双抗夹心法ELISA测定培养上清液中 TNF-α、IL-1、IL-6 的水平,试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，具体操作严格按检测试剂盒说明书进行。

1.2.4TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA的检测用RT-PCR法检测培养细胞TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA表达水平，试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，具体操作严格按检测试剂盒说明书进行。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。内参基因GAPDH，目的基因TNF-α、IL-1、IL-6扩增条件为：预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，再次延伸72 ℃ 7 min，预变性、变性和退火循环30次，延伸72 ℃ 45 s，4 ℃保存。

2结果

2.1PMA诱导THP-1细胞株转化为Mф使用PMA与THP-1细胞株共育24 h后，诱导使其转化为Mф，显微镜下观察可见细胞由悬浮生长变为贴壁生长，见图1。

A：刺激前；B:刺激后。

图1PMA刺激前、后的细胞

2.2SpA对Mф增殖的影响SpA刺激THP-1细胞株24 h后,细胞增殖明显增加，见表1、图2。

表1　SpA对Mф增殖的影响

2.3SpA浓度对Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影响不同浓度SpA与Mф 孵育12 h后，取培养上清液测定TNF-α、IL-1和IL-6的水平，结果呈现一定的剂量和时间效应关系。SpA 刺激组与空白组相比，TNF-α、IL-1和IL-6的水平明显升高(P<0.05)，100与500 μg/mL SpA 组间无明显差异(P>0.05)，见表2、图3。

图2　SpA对Mф增殖的影响

SpA(μg/mL)TNF-αIL-1IL-60127.23±11.8347.19±4.8619.26±2.511201.53±9.5850.72±4.5319.86±2.8110214.67±8.3761.74±5.7727.35±3.56100248.81±9.2481.01±4.8935.27±3.76500246.78±9.3180.51±6.3345.62±4.32

图3　SpA水平对Mф分泌细胞因子的影响

2.4SpA刺激时间对Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影响用100 μg/mL SpA与Mф胞孵育6、12、24、48 h后取上清液，测定TNF-α、IL-1和IL-6的水平。结果显示SpA刺激组TNF-α、IL-1和IL-6的水平显著升高(P<0.01)，约12 h达到高峰(P<0.01)，12、24与48 h组间比较无明显差异(P>0.05)，见表3、图4。

表3　SpA刺激时间对Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影响

2.5SpA刺激水平对Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影响用10 μg/mL SpA与Mф孵育12 h，测定沉淀细胞TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA水平。PCR扩增产物经凝胶电泳后，图像经Bandscan软件进行密度分析，以目的基因电泳条带总灰度值与β-actin电泳条带总灰度值之比(RQ)作为目的基因mRNA的相对表达量。结果显示SpA刺激组TNF-α、L-1和IL-6 mRNA的表达明显升高(P<0.05)，100 μg/mL与500 μg/mL组间无明显差异(P>0.05)，见表4、图5。

图4　SpA刺激时间对Mф分泌细胞因子的影响

表4　SpA浓度对Mф表达细胞因子 mRNA的影响

图5　SpA刺激浓度对Mф表达细胞因子mRNA的影响

2.6SpA刺激时间对Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影响结果显示SpA刺激组在各时间点均高于空白组，且于12 h达到高峰(P<0.01)，12 h与24 h和 48 h组间无明显差异(P>0.05),见表5，图6、7。

表5　SpA刺激时间对Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影响

图6　SpA刺激时间对Mф表达细胞因子mRNA的影响

图7　SpA刺激Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA 凝胶电泳图

3讨论

早期致炎细胞因子能启动脓毒症按顺序性、进行性，甚至是不可逆性方向发展。因此，深入研究致炎细胞因子与脓毒症的确切发病机制，寻找防治脓毒症的新靶点，是当今医学亟待解决的重要课题。

SpA是金葡菌表面蛋白抗原，可激活多种免疫细胞表达和释放多种与炎症相关因子，特别是Mф表达和释放的早期致炎细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。TNF-α 可使血管内皮细胞功能改变，造成微循环血栓形成及组织损伤。IL-1为多功能细胞因子，其与相应受体结合，触发早期感染免疫应答，导致组织损伤，具有促进炎症的作用。IL-6 被认为与SIRS 的严重程度和致死率密切相关，它除对血管内皮细胞及炎性细胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要是催化和放大炎性反应和毒性作用，造成组织细胞的损害[13-15]。因此，TNF-α、IL-1和IL-6 是机体炎症反应和免疫调节过程中的重要介质，作为早期致炎因子，在启动SIRS，诱导MODS中扮演极其重要的角色。

本实验结果显示，不同浓度SpA与THP-1细胞株共育24 h后，THP-1细胞增殖明显增加，与对照组比较有显著差异(P<0.05)。SpA 浓度为100 μg/mL时，刺激细胞增殖作用达高峰，而100 μg/mL与500 μg/mL SpA组结果无明显差异(P>0.05)，表明SpA在一定浓度范围内可明显增强THP-1细胞增殖。用PMA将THP-1诱导为Mф后，与不同浓度的SpA共同孵育一定时间，测定上清液中TNF-α、IL-1和IL-6的量。SpA浓度为100 μg/mL时Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6达高峰，提示SpA须达到一定的浓度才具备促进细胞因子分泌的作用。SpA刺激Mф 6 h就可使培养上清液中TNF-α、IL-1和IL-6的水平升高，12 h达高峰，与对照组比较，有显著差异(P<0.01)，12 h 与24 h相比，无明显差异(P>0.05)，表明SpA促进TNF-α、IL-1和IL-6的分泌遵循一定的剂量-效应和时间-效应关系，且在释放细胞因子的时间点上符合早期致炎细胞因子的特点。Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA水平的实验结果与上述实验结果相一致，100 μg/mL SpA可明显促进TNF-α、IL-1和IL-6相应mRNA的表达，与对照组相比，有显著差异(P<0.01)，且其促进作用遵循一定的剂量-效应和时间-效应关系，即在一定剂量和时间内，SpA可明显增强Mф表达TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA。

本实验表明SpA可刺激Mф表达和释放大量早期致炎细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。SpA在启动金葡菌性脓毒症中，应具有不可忽视的作用。本报道为实验室研究，SpA在体内如何参与启动脓毒症尚待深入研究。

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Effect of staphylococcal protein A on pro-inflammatory cytokines expression in mononuclear macrophage*

Ma Xinglong1,Huang Yulin2,Chen Xiaoqing2,Li Mingqiang3,Liu Qingmeng3△

(1.Department of ICU,the Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563002,China;2.Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China;3.Department ofMicrobiology,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression and regulation of pro-inflammatory cytokinesTNF-α,IL-1,IL-6 in mononuclear macrophages stimulated with staphylococcal protein A (SpA).MethodsTHP-1 was incubated with PMA and induced into mononuclear macrophages.Then the macrophages were incubated with varying concentrations of SpA under different time points.The effect of SpA on macrophage proliferation was measured by MTT method.The levels of inflammatory cytokines,TNF-α,IL-1 and IL-6 from the cultured cell media were measured by ELISA respectively.The levels of mRNA expression corresponding to TNF-α,IL-1 and IL-6 were detected by RT-PCR from the macrophages stimulated with SpA.All statistical analyses were performed by SPSS17.0 software.ResultsThe MTT result indicated that SpA had a positive effect on the proliferation of THP-1 cells in a dosage depended manner.The addition of SpA could enhance the mRNA expression of TNF-α,IL-1 and IL-6 in the stimulated macrophages.It also showed a specific dose-effect and time-effect correlation.The macrophages secreted inflammatory cytokines and its corresponding mRNA reached its peak levels at 12 h post stimulation.Compared with the control group,the expression and release of TNF-α,IL-1 and IL-6 in macrophages from the experimental group was increased with statistical significance(P<0.01).ConclusionSpA can promote the secretion and expression of early pro-inflammatory cytokines,such as TNF-α,IL-1 and IL-6 in macrophages.Therefore,SpA plays a very important role in the initiation and development of the staphylococcus aureus sepsis.

[Key words]staphylococcal protein A;THP-1；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-1；interleukin-6

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.013

* 基金项目：贵州省大学生创新课题(201413653004)。

作者简介：马兴龙(1972-)，副主任医师，在职硕士，主要从事脓毒症研究。△通讯作者，E-mail:2446545484@qq.com。

[中图分类号]R378.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)11-1484-04

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-01-16)