1例疑似急变的CML患者的实验诊断

马　强，刘青松，蔡　燕，何　城，梁　骑，刘　馨，王　静，张国元，郭晓兰*

(1.川北医学院附属医院 检验科；2.川北医学院 转化医学研究中心；3.川北医学院附属医院 病理科；4.川北医学院附属医院 血液科，四川 南充637000)



*通讯作者

1例疑似急变的CML患者的实验诊断

马强1,2，刘青松1，蔡燕1,2，何城1，梁骑1，刘馨3，王静4，张国元1,2，郭晓兰1,2*

(1.川北医学院附属医院 检验科；2.川北医学院 转化医学研究中心；3.川北医学院附属医院 病理科；4.川北医学院附属医院 血液科，四川 南充637000)

慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，疾病过程包括慢性期、加速期和急变期。处于慢性期的病人经过数月或数年之后可发生急变，此时恶性造血干细胞极度增生，可引起不明原因的发热，脾进一步增大，出现骨痛、出血以及髓外肿物等浸润现象，如皮肤组织肿块，淋巴结肿大等。本例研究对象为男性，38岁，5年前诊断为“慢性粒细胞白血病”，给予干扰素、羟基脲等治疗后白细胞逐渐降至正常，临床症状好转出院。近1月，患者自述服药不规律，间断服药，并曾停药近1周，后出现头部胀痛，并逐渐累及眶周，伴眼花，眩晕感，10余天前检查发现白血病再次升高(WBC 100+×109/L)，继续口服甲磺酸伊马替尼辅以布洛芬治疗5天，白细胞为75.7×109/L，以“慢性粒细胞白血病”入院。体格检查未发现脾进行性增大，血常规未发现血小板进行性增高或降低，但患者左上肢及双下肢存在多个棕色疣状突起物，故依然存在急变可能，遂做以下研究。

1材料与方法

1.1标本

1.1.1骨髓患者取左侧屈膝卧位，以右侧髂后上脊为穿刺点，常规消毒铺巾，2%利多卡因逐层麻醉后，持穿刺针旋转进针获落空感，拔出针芯，抽取骨髓大约 5 ml。其中0.2 ml用于骨髓细胞形态学检验，3 ml用于染色体核型分析，1 ml用于检测BCR-ABL融合基因，另外1 ml用于检测SRY基因。另外收集正常男性和女性的外周血各1 ml。

1.1.2皮肤结节患者取平卧位，常规消毒铺巾，以2%利多卡因在大腿内侧皮肤结节处作局部浸润麻醉，麻醉满意后在皮肤结节周围做梭形切口，切除皮肤及皮下组织，止血满意，缝合切口，组织送病理活检。

1.2方法

1.2.1骨髓细胞形态学分析抽取0.2 ml骨髓，立即涂片于2张洁净的载玻片上，自然干燥。一张涂片瑞氏染色后，在普通光学显微镜下连续分类计数300个细胞，分别计算各系统各阶段细胞的百分率。另外一张进行NAP染色，计算NAP阳性率和NAP积分。

1.2.2骨髓细胞染色体核型分析抽取3 ml骨髓，肝素抗凝，计数后按2×106/L接种于骨髓培养基，培养24 h后，收获细胞，低渗，滴片，显带，吉姆萨染色，按照《人类细胞遗传学命名的国际体制》(2009版)标准对该患者的染色体核型进行分析。

1.2.3骨髓BCR-ABL融合基因检测及ABL激酶区突变位点筛查 提取骨髓细胞RNA，送四川金域医学检验中心做BCR-ABL融合基因检测和ABL激酶区突变位点筛查。

1.2.4SRY基因检测采用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书步骤提取患者骨髓细胞、一例正常男性和一例正常女性外周血DNA，分别做SRY基因检测。SRY基因扩增引物[1]：Forward：5′-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3′，Reverse:5′-GTTACCCGATTGTCCTACAGCT-3′，目标片段677 bp。扩增反应体系为：2×master mix 12.5 μl,Forward primer 0.5 μl,Reverse primer 0.5 μl,ddH2O 10.5 μl,DNA template 1 μl。扩增反应条件：95℃ 10 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，35个循环；72℃ 10 min。产物在1%琼脂糖凝胶中，恒压160伏电泳20 min后，于凝胶成像仪中拍照。

1.2.5皮肤疣状突起物活检皮肤疣状突起物组织石蜡切片后，严格按照HE染色的步骤制片，在普通光学显微镜下对该患者组织进行形态学分析。

2结果

2.1骨髓细胞形态学

骨髓涂片细胞形态学提示，粒：红=31.3，原始粒细胞占3.4%，早幼粒细胞占4.2%，中性中幼粒细胞占17.7%，中性晚幼粒细胞占18.5%，中性杆状核粒细胞占12.6%，中性分叶核粒细胞占15.1%，嗜酸性分叶核粒细胞占4.2%，嗜酸性分叶核粒细胞占3.4%，中幼红细胞占1.7%，晚幼红细胞占0.8%，成熟浆细胞占0.8%；NAP阳性率为4%，NAP积分为4分，骨髓细胞形态学特点符合慢性粒细胞白血病的特征(图1)。

2.2骨髓细胞染色体核型

按照ISCN2009的标准，分析20个中期分裂相，所见核型均为47，X，-Y ，+8，t(9:22)(q34；q11)，+der(22)t(9；22)[20](图2)。

图1　患者骨髓细胞形态学(瑞氏染色，10×100倍)

图2　患者骨髓细胞染色体核型

2.3骨髓细胞BCR-ABL融合基因检测ABL激酶区突变位点筛查

四川金域医学检验中心检测BCR-ABL融合基因结果提示，BCR-ABL融合基因P210型阳性(荧光定量PCR法)，并且ABL激酶区未发现突变位点(直接测序法)。

2.4骨髓细胞SRY基因检测

骨髓细胞SRY基因检测结果显示，患者骨髓细胞与正常男性SRY基因扩增产物在677bp处可见一条均一的条带，而女性对照和阴性对照无此条带，故该患者骨髓细胞SRY基因阳性(图3)。

2.5皮肤结节病理检查

HE染色后病理检验结果提示，左上肢及双下肢疣状突起物为纤维瘤(图4)。

3讨论

CML是迄今发现的第一例与染色体异常直接相关的恶性肿瘤，90%左右的患者存在由9号和22号染色体长臂相互易位而产生的特征性Ph染色体和(或)BCR-ABL融合基因[2]。BCR-ABL编码的P210蛋白具有酪氨酸激酶活性，其使信号通路异常激活，MYC和BCL2转录增加，使造血干细胞增殖失控，凋亡受阻，细胞发生恶性转化。Ph染色体或BCR-ABL融合基因是CML患者重要的诊断、治疗和预后标志。

图3患者SRY基因检测

图4　患者皮肤结节病理切片(HE染色，10×40倍)

CML慢性期可以持续的时间相对较长，病情相对稳定；而急变期病情凶险，预后较差。本例患者左上肢及双下肢出现棕色疣状突起物，形似绿色瘤，但病理活检提示为纤维瘤。同时，未发现血小板进行性增高或降低，也未发现脾进行性增大，故目前排除慢粒急变，该患者依然处于CML慢性期。实验室检查发现，该患者BCR-ABL融合基因阳性，并且ABL激酶区未发现突变位点，故目前该患者治疗上甲磺酸伊马替有效，故继续甲磺酸伊马替尼控制白血病数量，碱化尿液，抑制尿酸生成等治疗。

骨髓染色体核型分析提示患者存在-Y、+8和+Ph染色体等额外的染色体异常。CML慢性期出现额外染色体异常约为7%，而在加速期或急变期可达到40%-70%[3,4]，故CML出现额外染色体异常时常常提示疾病可能进展[5]。+8是CML、急性粒细胞白血病、骨髓异常增生综合征、急性淋巴细胞白血病等疾病中最常见的数目异常，其中以CML患者出现+8的频率最高[6]，并且+8也是CML患者最主要的额外染色体异常，经常伴有其他额外染色体，比如+Ph[7]。+8，+Ph，+19，i(17q)等是CML加速期或者急变期最典型的染色体畸变，经常先于临床急变期2-4个月，并且预后较差[8-10]。

此外，-Y也是CML患者一种额外的染色体异常，研究发现，3.6%左右的CML患者可以检测出骨髓细胞Y染色体的丢失[7]。本例患者骨髓细胞染色体核型分析提示Y染色体的丢失，但是PCR结果提示SRY基因阳性，一方面骨髓中部分肿瘤细胞可能存在Y染色体，因为染色体核型仅仅分析了20个中期分裂相，检测能力有限；另一方面可能是骨髓中也存在部分正常细胞，虽然粒系增生明显活跃(粒∶红=31.3∶1)，而红系、淋巴系增生受抑，但依然可能产生正常的红细胞和淋巴细胞，SRY基因也可呈阳性。

综上所述，虽然临床表现和骨髓形态学均提示该患者目前处于CML慢性期，但是骨髓染色体核型分析发现存在额外的染色体异常，特别是双Ph染色体，因为染色体异常可以先于临床表现数月，故该患者在坚持目前的治疗外，应尽早进行骨髓移植，同时应该定期复查血常规、骨髓细胞形态学以及染色体核型，以便及时发现CML急变并采取相应的治疗措施，从而延长患者的生存期，改善患者的生活质量。

参考文献：

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[9]孙川，李倩，林颖.慢性粒细胞白血病额外染色体异常在加速期和急变期的意义[J].医学研究杂志,2014,43(1):108.

[10]Aydin C,Cetin Z,Salim O,et al.Previously Unreported Chromosomal Aberrations of t(3;3)(q29;q23),t(4;11)(q21;q23),and t(11;18)(q10;q10) in a Patient with Accelerated Phase Ph+ CML[J].Case Rep Genet,2014,2014:582016.

1泳道：CML患者；2泳道：正常男性对照；3泳道：女性对照；4泳道：阴性对照2.5 皮肤结节病理检查

文章编号：1007-4287(2016)05-0843-03

作者简介：马强(1987-)，男，检验师，硕士研究生，研究方向：肿瘤的分子遗传学基础；郭晓兰，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向为肿瘤的信号转导通路。

(收稿日期：2014-10-17)