大鼠视网膜毛细血管铺片的制作技巧改进

董学美，郭文辉，罗维芸，许世清，蔡寒青*

(1.吉林大学第二医院 内分泌科，长春130041；2.中日友好医院 临床医学研究所，北京100029)



*通讯作者

大鼠视网膜毛细血管铺片的制作技巧改进

董学美1，郭文辉1，罗维芸1，许世清2，蔡寒青1*

(1.吉林大学第二医院 内分泌科，长春130041；2.中日友好医院 临床医学研究所，北京100029)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见而严重的微血管并发症之一，发病率随着糖尿病病程的延长而增加，是导致糖尿病患者视力下降、甚至失明的主要原因[1]，其微血管结构的改变，临床大多是通过检眼镜或眼底荧光素血管造影观察得到[2]。为研究糖尿病视网膜病变的发病机制，近年来通过制备糖尿病大鼠模型及其视网膜微血管消化铺片，来观察糖尿病视网膜微血管病变的形态学[3]及进行糖尿病视网膜病变机制的研究越来越多[4]，但由于制备视网膜铺片标本在技术操作上存在一定难度，往往难以获得较大面积的高质量视网膜毛细血管铺片，故影响到实验室观察和计量结果，限制了该实验方法的广泛应用。近年来我们在制备大鼠视网膜毛细血管铺片过程中摸索出一些技巧，介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器pH 值为7.4、0.01 mol/L 的PBS液(美国Amresco公司)；4%多聚甲醛液(美国Sigma公司)；3%胰蛋白酶液(美国Amresco公司)；小牛血清(美国Gibco公司)；Schiff试剂(国产，碧云天公司)；10%偏重亚硫酸钠液(美国Sigma公司)；Mayer’s苏木素(国产，碧云天公司)；37℃温水浴锅(国产EYELA公司)；显微镜(日本Olympus公司)。

1.1.2实验动物7-8周龄的Wistar大鼠10只，雌雄各半，体重250-300 g，均自北京维通利华实验动物技术有限公司购买[合格证号：SCXK(京)2006-0009]，并饲养于中日友好医院临床医学研究所的SPF级动物实验室中。

1.2方法

1.2.1视网膜的消化分离以1%的戊巴比妥一次性腹腔注射麻醉后，经静脉放血处死Wistar大鼠，以眼科剪立即摘取眼球，浸泡于4%的多聚甲醛溶液中，置于室温下固定达72 h。然后以浓度0.01 mol/L，pH 值为7.4的PBS缓冲液浸泡过夜。次日取固定好的眼球，在盛有PBS缓冲液的干净玻璃平皿中，从角膜缘后0.5 mm处剪开，去除眼前节和玻璃体，从剩下的眼杯内壁仔细剥离出视网膜，转浸入5 ml含有3%胰蛋白酶的溶液中，置于37℃的恒温水浴中震荡、消化2 h。此时加入2 ml冷的10%小牛血清并置于冰上冷却以中止消化，将其转入干净平皿，用自制的小圆头玻璃棒轻轻拨动，使视网膜舒展地平铺并漂浮在水中；再用玻棒从其下方托起，移入另一装有适量蒸馏水的干净平皿中。在蒸馏水中反复轻轻拨动震荡视网膜，直至完全清除神经及其他纤维成分。

1.2.2视网膜的铺片在一洁净的载玻片上先滴一滴蒸馏水，再用玻璃棒挑起已消化干净的视网膜血管网，迅速转移至载玻片上的水滴中，不断轻柔转动玻璃棒，使视网膜血管网自然伸展开并漂浮在水滴上，注意避免重叠，然后置于平台上待蒸馏水在室温下自然挥发干燥。

1.2.3PAS染色将完全干燥后伸展铺于载玻片上的视网膜血管铺片再次用蒸馏水轻洗，以滴管滴一滴1%的高碘酸，室温下氧化5 min，然后反复用蒸馏水清洗5 min，再以Schiff试剂染色15 min。在流水下清洗10 min，再用适量Mayer’s苏木素液复染细胞核3 min，最后用流水清洗。脱水封片后即可在光镜下观察视网膜血管形态学改变，如需计量，即可在高倍镜下记数1000个毛细血管细胞，并计算内皮细胞/周细胞(E/P)比值。

2结果

制备良好的视网膜铺片，当在低倍镜下观察时(图1a)，可见整张视网膜血管网大而清洁，无折叠、破损或卷曲成团。各级小血管分布清晰，毛细血管排列分布自然顺畅，结构完整，各毛细血管之间无神经及其他纤维成分的残留。当在高倍镜下观察时(图1b)，可见毛细血管网络样结构完整，分布无扭曲；毛细血管内皮细胞细胞核呈长椭圆形，细胞染色较淡。毛细血管周细胞的细胞核则呈圆形，染色相对较深。

图1　大鼠视网膜铺片(PAS染色，1a ×20；1b ×100 )

3讨论

1960年Kuwabara和Cogan[5]发明了视网膜血管铺片技术，1963年Ashton[6]又对该技术进行了改进。参照一些文献的介绍[3,5-7]，我们摸索了一些制做高质量大鼠视网膜毛细血管网铺片的经验，现总结如下：

3.1视网膜的消化分离多聚甲醛对组织穿透性强，能保持组织抗原性，且引起组织的收缩性小，较适合于光镜下观察组织细胞形态的研究。我们在处死大鼠取眼球后，经多次摸索的组织固定条件为4%多聚甲醛室温下固定72 h后再分离视网膜的效果最佳。为充分去除视网膜结构中的神经组织又不过度损害微血管结构和形态，我们采用将视网膜浸于含3%胰酶的溶液于37℃水浴中不断震荡进行消化共2 h而非单纯静置消化，使消化分离过程更加充分；当消化结束时则迅速加入冷的小牛血清并迅速转入冰浴中冷却中止消化，防止因消化过度而损伤毛细血管网的完整性；之后可以通过反复在蒸馏水中机械漂洗经胰酶消化过的视网膜，帮助充分去除残存的神经组织和基质成分。

3.2铺片时需注意的问题实验操作中动作应轻柔、迅速、准确，并事先做好相应的准备：如从平皿蒸馏水中托出消化好的血管网后，要及时、快速地将其转移浸入载玻片的蒸馏水水滴中，注意应避免将其在干燥的空气中晾置时间过长致使视网膜血管网风干而粘附于玻棒上造成破坏；另外，移动视网膜前必须在平皿中顺一个方向轻轻转动玻棒，使视网膜血管网能充分展开漂浮于水中再移动其转入玻片；转入玻片的水滴后应再次轻轻转动玻棒将其再次自然展开铺在小水滴上，避免干燥后出现折叠的现象。

3.3制备良好的操作工具视网膜经胰酶消化后，神经及纤维组织清除干净，使之变得十分菲薄稀疏，暴力操作极易造成其破损或粘连，因此需要有合适的工具进行所有操作。我们曾经先后试用过如眼科镊、自制烧弯的玻璃吸管等工具，均易造成了血管网的破损和粘连，制作效果不尽人意。最终参照项晓人等[7]的方法，自行制备了小圆头玻璃棒用于剥离和转移大鼠视网膜，大小适合的玻璃棒光滑的圆面不会造成粘连和血管网的破损，因此大大提高了视网膜铺片的成功率及质量。

总之，通过反复试验摸索和技术改进，我实验室目前能够成功制备高质量的大鼠视网膜毛细血管铺片，为进行糖尿病微血管病变的实验研究奠定了基础。

参考文献：

[1]Frank RN.Diabetic Retinopathy[J].New England Journal of Medicine,2004,35(1):48.

[2]Gerald Liew,Jie Jin Wang,Paul Mitchell,et al.Retinal Vascular Imaging:A New Tool in Microvascular Disease Research[J].Circ Cardiovasc Imaging，2008，1;156.

[3]潘琳，周水平，郭艳茹，等.糖尿病视网膜微血管形态学改变的实验研究[J].中华眼科杂志，2004，40(6):416.

[4]许世清，姜永玮，王慧，等.糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变[J].中华糖尿病杂志，2010，2(5):262.

[5]Kuwabara T,Cogan DG.Studies of retinal vescular patterns.I.Normal architecture[J].Arch Ophthalmol，1960，64:904.

[6]Ashton N.Studies of the retinal capillaries in relation to diabetic and other retinopathies[J].Brit J Ophthal，1963，47:521.

[7]项晓人，王坚，朱荃.视网膜毛细血管铺片制作技巧.临床与实验病理学杂志，2002，18(5)：564.

基金项目:吉林省科技厅基金项目(编号：201215054)

文章编号：1007-4287(2016)05-0710-02

作者简介：董学美(1990-)，在读硕士研究生；蔡寒青(1972-)，女，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要从事糖尿病及内分泌代谢疾病的诊治。

(收稿日期：2015-09-17)