新饲料添加剂对百里香酚的开发和应用研究

■彭险峰 易家红 肖 灿

（广州英赛特生物技术有限公司，广东广州 510663）

1946年首次报道了链霉素可刺激雏鸡生长[1]，1950年美国食品与药物管理局首次批准抗生素用作饲料添加剂。此后，抗生素作为饲料添加剂被大范围的推广和应用，从而导致了细菌耐药性、食品动物产品中残留和环境污染及危害人的健康等问题[2-3]。欧盟已于2006年开始全面禁止在饲料中使用抗生素作为动物生长促进剂[4]，许多国家或地区也在推进禁用促生长抗生素。因此，有效的抗生素替代产品的研究开发正成为饲料添加剂工业发展的一个重要方向。对百里香酚为百里香酚的同分异构体，化学名为3-甲基-4-异丙基苯酚，分子式为C10H14O，分子量为150.218，熔点112℃，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。研究发现，对百里香酚比百里香酚有更强的抗菌活性、更低的挥发性、更高的安全性、具有更好的适口性及促生长效果。试验研究对百里香酚对大鼠的急性毒性、体外抗菌活性及肉鸡饲养。

1 材料与方法

1.1 试验材料

对百里香酚，纯度≥98%，批号20130806，由广州英赛特生物技术有限公司提供。百里香酚、香芹酚购自Sigma公司，分析纯。金霉素为市售预混剂，含量15%。

培养基：LB液体培养基、TSB液体培养基、FT培养基，由广东环凯生物科技有限公司提供。

测试菌株：大肠杆菌159、大肠杆菌020、大肠杆菌147、鸡伤寒沙门氏菌206、鸭沙门氏菌118、猪霍乱沙门氏菌141、金黄色葡萄球菌871、金黄色葡萄球菌810、金黄色葡萄球菌837、产气荚膜梭菌859、产气荚膜梭菌795、产气荚膜梭菌591，由广州英赛特生物技术有限公司分离鉴定并保存。

试验动物及饲料：Wistar大鼠，购自南方医科大学实验动物中心，体重150～180 g，雌、雄各半，自由采食和饮水，饲料为不含任何药物的全价料。岭南黄快大肉鸡，由广东省农业科学院畜牧研究所种鸡场提供；102型肉鸡饲料（不含抗生素），广东省农业科学院畜牧研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 体外抗菌活性试验

冻干菌种按菌种恢复培养方法[5]恢复培养，采用试管二倍稀释法[6]测定对百里香酚对鸡伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的体外最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），并比较百里香酚及香芹酚的抗菌活性差异。

1.2.2 经口急性毒性试验

采用简化寇氏法[7]进行大鼠急性毒性试验。动物在饲养观察3 d后选用体重相近的健康大鼠进行预试，测定对百里香酚、百里香酚和香芹酚大鼠死亡率在0～100%的剂量范围分别为4 000～8 000、500～1 200、500～1 400 mg/(kg·bw)。选用体重相近的健康大鼠随机分成15组，每组10只，雌、雄各半，分别灌服不同剂量的对百里香酚、百里香酚及香芹酚。连续观察7 d，记录大鼠的中毒表现及死亡情况。根据试验各组死亡率结果计算其LD50及95%可信限。

1.2.3 肉鸡的饲养试验

1.2.3.1 不同剂量对百里香酚对肉鸡的促生长效果试验

试验设20、50、100、500 mg/kg 4个剂量组及一个空白对照组，250只肉鸡随机分成5组，每组50只。饲养21 d后统计各组试验鸡的存活率、增重及料肉比。

1.2.3.2 对百里香酚、百里香酚及金霉素对肉鸡促生长比较试验

600只肉鸡随机分成4组，每组3个重复，每个重复50只。各试验组分别在饲料中添加100 mg/kg的对百里香酚、百里香酚及50 mg/kg的金霉素，空白对照组不加任何药物，饲养21 d后统计各组的增重及料肉比。

2 结果与分析

2.1 体外抗菌活性试验结果

肉眼观察有无细菌生长，阳性可见混浊生长，阴性可见澄清。对百里香酚对大肠杆菌、沙门氏杆菌、金色葡萄球菌、产气荚膜梭菌最小抑菌浓度（MIC）均为100 μg/ml，且抗菌活性较百里香酚和香芹酚强1～2倍，结果见表1。

表1 对百里香酚、百里香酚及香芹酚的抗菌活性比较研究结果（MIC，μg/ml）

2.2 急性毒性试验结果（见表2）

表2 对百里香酚、百里香酚及香芹酚对大鼠的急性毒性试验结果

对百里香酚、百里香酚和香芹酚对大鼠的LD50分别为6 174.9、835.4、968.1 mg/(kg·bw)，95%可信限分别为5 701.4～6 687.8、764～913.3、878.8～1 066.4 mg/(kg·bw)，结果显示，对百里香酚比百里香酚和香芹酚的安全性分别提高约7倍和6倍。

2.3 肉鸡的饲养试验

2.3.1 不同剂量对百里香酚对肉鸡的促生长试验结果（见表3）

表3 不同剂量的对百里香酚对肉鸡促生长试验的结果

鸡饲养试验结果表明，各组均未出现动物死亡，存活率均为100%，且不同剂量的对百里香酚对肉鸡均有促生长作用。与空白对照组相比，各试验组的相对增重率提高了4.66～7.39个百分点，且与添加量呈正相关。此外，添加对百里香酚的试验组还能不同程度地改善饲料报酬，与空白对照组相比，料肉比降低0.061～0.108。

2.3.2 对百里香酚、百里香酚及金霉素对肉鸡促生长的比较试验结果（见表4）

表4 对百里香酚、百里香酚及金霉素对肉鸡促生长的比较试验结果

在饲料中分别添加各100 mg/kg的对百里香酚、百里香酚或50 mg/kg的金霉素后，与空白对照组相比，对百里香酚有明显的促生长作用，相对增重率提高6.73个百分点，平均料肉比降低0.096；而百里香酚和金霉素试验组的相对增重率仅分别提高2.69个百分点和4.11个百分点，平均料肉比分别降低0.037和0.054，其促生长效果低于对百里香酚试验组。

3 小结

从对百里香酚、百里香酚和香芹酚对4种常见细菌的抗菌活性可见，对百里香酚对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌）和革兰氏阴性细菌（大肠杆菌和沙门氏菌）均有抗菌活性，最小抑菌浓度为100 μg/ml，优于百里香酚和香芹酚。大鼠急性中毒时，其主要症状腹泻的程度与给药剂量有关，即有剂量效应关系，随着剂量的增加，腹泻程度加重，动物的死亡均因腹泻引起的脱水、衰竭所致。最初排出的粪便呈乳白色（对百里香酚的颜色）油状，腹泻重症在第2～4 d死亡，轻症可达7 d之久，耐过者逐渐恢复正常。致泻原因是给药剂量较大，造成胃扩张，引起消化、吸收不良；同时对百里香酚不溶于水，用玉米油制成混悬液，过量的玉米油也可引起腹泻。对百里香酚对大鼠的LD50为6 174.9 mg/(kg·bw)，按化合物经口急性毒性分级标准属相对无毒级范畴[相对无毒大鼠口服LD50为5 000～ 50 000 mg/(kg·bw)][8]。

肠道微生物的组成受饲粮成分的影响，而肠道微生物又可通过影响养分的利用和胃肠道系统的发育来影响宿主的营养、健康和生长，这种相互作用十分复杂。对百里香酚通过破坏细菌细胞膜pH值稳态和无机离子平衡，导致细菌死亡。本研究的肉鸡促生长试验结果表明，在饲料中添加100 mg/kg的对百里香酚能显著提高相对增重率和降低料肉比，优于添加100 mg/kg的百里香酚和50 mg/kg的金霉素。

试验结果显示，对百里香酚比百里香酚和香芹酚的抗菌活性提高了1～2倍，安全性提高了6～7倍，促生长效果明显优于百里香酚和金霉素，因此，对百里香酚作为促生长添加剂可替代金霉素。