LC-MS/MS同时分析血液中8种苯二氮卓类药物

孙会会，仲建军（山东省德州市公安局，山东德州253000）



LC-MS/MS同时分析血液中8种苯二氮卓类药物

孙会会，仲建军
（山东省德州市公安局，山东德州253000）

摘要：建立LC-MS/MS同时对血液中8种苯二氮卓类药物进行定性定量分析的方法。采用岛津LC-20AD高效液相色谱仪与AB Sciex3200 Q TRAP质谱仪联用法，Phenomenex C18色谱柱，高纯水-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。8种化合物的线性范围0.5～200ng·mL-1，相关系数均高于0.998；8种化合物的检测限（S/N≥3）均低于0.3ng·mL-1。方法重现性好，准确度高，可用于强奸、抢劫、杀人等案件的血液检材中苯二氮卓类药物的定性定量分析。

关键字：LC-MS/MS；血液；苯二氮卓类

苯二氮卓类（Benzodiazepines）是一类中枢神经系统药物，临床常见的有安定（地西泮）、阿普唑仑、三唑仑、艾司唑仑等，具有抗焦虑、镇静催眠、抗惊厥、抗癫痫、肌肉松弛和安定作用。作为安眠镇静类药物，在近几年常被犯罪分子用于麻醉抢劫、强奸、杀人，引起了公安部门的高度重视。

测定血液中苯二氮卓类药物多采用气相色谱质谱联用法（GC-MS）、液相色谱质谱联用法（LC-MS）。传统利用GC-MS测定血液中苯二氮卓类镇静安眠药采取的是衍生化方法，比较繁琐，使用的有机试剂毒性大。LC-MS可以检验难气化，沸点高的化合物，前处理方法简单，样品检验的范围广，仪器灵敏，选择性好，无需进行衍生化，适宜进行苯二氮卓类化合物的检测。

本文建立了血液中8种苯二氮卓类药物的高效液相色谱-四级杆离子阱串联质谱（LC-MS/MS）检验方法，采用多反应监测模式（MRM），选取两对离子对分析，该方法简单快捷，重现性好，精密度高，适宜应用于法医临床毒物的筛查和定量检测。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

岛津LC-20AD高效液相色谱仪；ABSciex3200 QTRAP质谱仪；TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；VORTEX-GENIE2涡轮振荡器（Scientific Industries）；BSA-323S电子天平（德赛多利斯）；容量瓶；移液枪（上海华运分析仪器有限公司）；有机微孔滤膜（0.22μm）。

乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；高纯水；安定（地西泮）、阿普唑仑、氯硝安定、艾司唑仑（舒乐安定）、三唑仑、利眠宁（氯氮卓）、咪哒唑仑、硝安定标准品均购自公安部，纯度均大于99.1%。

安定（地西泮）、阿普唑仑、氯硝安定、艾司唑仑（舒乐安定）、三唑仑、利眠宁（氯氮卓）、咪哒唑仑、硝安定配置成浓度1μg·mL-1的标准储备液。

1.2样品处理

在1mL的血样中加入3mL乙腈，振荡10min，在转速5000r·min-1下离心15min，取上清液，经微孔滤膜过滤，备检。

1.3色谱条件

色谱柱：PhenomenexC18柱（50mm×2mm,2.5μm），柱温：40℃，进样量1μL，流速0.6mL·min-1，高纯水-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，程序见表1。

表1　梯度洗脱程序Tab.1 The program of gradient elution

1.4质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描（ESI+）；检测方式：MRM；离子喷射电压（IS）：5500V；碰撞气N2（CAD）:Medium；气帘气（CUR）：20psi；离子源气Gas1：15psi；离子源气Gas2：15psi；离子源温度：500℃。

表2　8种苯二氮卓类药物LC-MS/MS条件Tab.2 LC-MS/MS conditions for 8 benzodiazepines

2　结果与讨论

2.1定性与定量条件

每种化合物选取了两对离子对进行定性分析，利用其中一对离子对进行定量分析。每种化合物选取的离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）如表2所示。

2.2色谱柱的选择

色谱柱是HPLC的心脏。本文选择了不同粒径、不同长度和不同柱径的色谱柱进行比较。由于苯二氮卓类目标物极性较弱，故采用C18反相色谱柱；实验结果表明，较细的柱粒径有助于提高分离分析效率，但会导致柱压升高；长色谱柱有利于增加分离度，但延长了分离时间，增加了时间成本。综合以上因素，结合各种化合物的分离情况以及苯二氮卓类药物的性质，选择PhenomenexC18色谱柱（50mm× 2mm,2.5μm）作为本实验的色谱柱。

2.3流动相的选择

乙腈的溶剂强度比较高，粘度较小。实验中分别选择乙腈和甲醇作为有机相进行考察，发现当选择乙腈作为流动相时，各种化合物的分离效果比较好。同时考虑到实验的前处理用乙腈作为沉淀剂，沉淀血液中的蛋白，所以本次实验选择乙腈作为有机相。

实验中考察等度洗脱对分离的效果，分别实验了10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%乙腈-水溶液进行等度洗脱，但是分离效果不好，化合物色谱峰出现交叉或重叠，所以实验选择梯度洗脱。

2.4标准曲线、线性范围和方法检测限

选择每种化合物响应最强的离子对进行定量分析。将实验中的8种苯二氮卓类药物添加到空白血中，配制成一系列不同浓度的溶液，确定每种化合物的线性范围，以便于定量检测。每种化合物的性质不一样，离子化的效率有差异，所以其检出限也不同，以S/N≥3为标准确定检出限。结果见表3。

表3　8种苯二氮卓类药物的线性范围与检出限Tab.3 Linear range and LOD of 8 benzodiazepines

2.5精密度与回收率

取空白血样，加入8种所测化合物的标准品溶液，配制成浓度分别为0.5、2、10、20、50ng·mL-1的标准添加工作液，每种浓度分别平行测定6次，连续测定6d，测得每种化合物的日内精密度（RSD%）均小于3.2%，日间精密度（RSD%）均小于5.1%。

取空白血样，加入8种所测化合物的标准品溶液，配置成浓度分别为0.5、10、50ng·mL-1的标准添加工作液，每种浓度平行测定3份，计算每种化合物的回收率。实验结果表明，利用乙腈沉淀蛋白，重现性好，每种物质的回收率都在80%以上。

2.6案例应用

2015年3月，某县公安局送检强奸致人死亡案件中被害人的静脉血一份，要求进行毒物成分定性定量分析，应用实验中建立的LC-MS/MS方法，检测出检材血中含有安定和艾司唑仑成分，含量分别为61和24ng·mL-1。谱图见图1～3。

图1　安定、艾司唑仑的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of diazepam and estazolam

图2　安定的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of diazepam

图3　舒乐安定的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of estazolam

3　结语

本文建立了8种苯二氮卓类药物的LC-MS/MS的检验方法，可以准确对每种化合物进行定性定量分析，该方法具有很好的重现性和准确性，为公安部门侦破苯二氮卓类药物相关案件提供了很好的技术支持。

参考文献

［1］汪丽萍,赵海乡,邱月明.硝西泮、氯硝西泮甲基衍生物的气相色谱-质谱分析［J］.分析测试学报，2005,24（6）:47-51.

［2］卓晓聪,谢瑜,褚建新.五氟丙酰衍生化-气相色谱/质谱联用法分析尿液中7-氨基硝西泮［J］.法医学杂志，2007,23（3）: 199-200.

［3］沈宝华,沈敏,卓先义，等.尿液中苯骈二氮卓类药物筛选分析研究法［J］.医学杂志，2002,18（1）:22-25.

［4］刘伟,沈敏,沈宝华，等.LC-MS/MS-MRM筛选血液中22种有毒生物碱成分［J］.法医学杂志，2007,23（5）:349-351.

［5］严慧,向平,卜俊，等.液相色谱-串联质谱法检测血液中的美西律［J］.法医学杂志，2007,23（6）:441-443.

Simultaneous analysis of 8 benzodiazepines in blood by LC-MS/MS

SUN Hui-hui，ZHONG Jian-jun
（Dezhou Public Security Bureau of Shandong Province, Dezhou 25300, China）

Abstract：A qualitative and quantitative method was established for detection of 8 benzodiazepines in blood by LC-MS/MS. The HPLC system was with Shimadzu LC-20AD pump and coupled to AB Sciex 3200 Q TRAP mass. Chromatographic separation was achieved by a Phenomenex C18 column（50mm×2mm, 2.5μm）. Water（A）and and acetonitrile（B）were used as mobile phase for gradient elution. The correlation coefficient of all the analytes were over 0.998 in the linear range of 0.5～200ng·mL-1, and the LODs were below 0.3ng/mL. This method was rapid, reliable and highly accuracy for qualitative and quantitative analysis of 8 benzodiazepines in blood concerning rape, rob or murder cases.

Key words：LC-MS/MS；blood；benzodiazepines

中图分类号：O657.72；S859.81

文献标识码：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160530

收稿日期：2015-12-24

作者简介：孙会会（1987-），女，硕士研究生，助理工程师，2012年毕业于中国科学技术大学分析化学专业。现从事毒物、毒品分析工作。