实时荧光定量聚合酶链反应检测尿沉渣中miR-146a的表达及在类风湿关节炎中的临床意义*

胡秋侠，李　博，吴系美，佘若男，谭锦辉，黄翠萍，唐群芳

（广东省深圳市龙华新区人民医院，广东深圳　518109）



实时荧光定量聚合酶链反应检测尿沉渣中miR-146a的表达及在类风湿关节炎中的临床意义*

胡秋侠，李博，吴系美，佘若男，谭锦辉，黄翠萍，唐群芳

（广东省深圳市龙华新区人民医院，广东深圳518109）

摘要：目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应（real time PCR）方法检测类风湿关节炎（RA）患者尿沉渣中miR-146a的表达情况，并分析其在RA中的临床意义。方法收集80例RA患者（活动期46例，非活动期34例）及40例健康体检者的清晨中段尿液，从尿沉渣中提取RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测尿沉渣中miR-146a表达水平，并分析其与RA病情活动性及RA临床表现之间的相关性。结果尿沉渣中miR-146a的表达水平，RA患者显著高于健康体检者［（0.70±0.04）比（0.17±0.01），P＜0.05］，活动期RA患者显著高于非活动期RA患者［（0.91±0.05）比（0.42±0.04），P＜0.05］，非活动期RA患者显著高于健康体检者［（0.42±0.04）比（0.17±0.01），P＜0.05］，有关节外表现的RA患者显著高于无关节外表现的RA患者［（1.13±0.12）比（0.59±0.04），P＜0.05］。尿沉渣中miR-146a的表达水平与RA患者的DAS28评分呈正相关性（r=0.675，P＜0.05）、与血沉（ESR）呈正相关性（r=0.657，P＜0.05）、与C-反应蛋白（CRP）水平呈正相关性（r=0.522，P＜0.05），但与病程（r=0.052，P=0.650）、类风湿因子（RF，r=-0.049，P=0.664）及抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体，r=0.089，P=0.433）的滴度水平无明显相关性（P >0.05）。结论miR-146a在RA患者尿沉渣中的表达显著增高，并与RA病情活动度及特定临床表现相关，提示miR-146a可能参与了RA的发病，可能有助于RA的诊断及病情活动性判断。

关键词：miR-146a；类风湿关节炎；外周血单个核细胞；类风湿因子

*广东省医学科研基金立项课题资助，项目编号：A2013611；广东省深圳市卫生计生系统科研项目（医疗卫生类）资助，项目编号：201302182，项目编号201501051；广东省深圳市龙华新区科技创新资金项目（医疗卫生类）资助，项目编号：2013010，项目编号：20150924A1030103。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵犯关节滑膜为特征的致残性自身免疫性疾病，主要病理特征为滑膜细胞过度增殖以及大量血管翳形成，造成骨、软骨侵蚀性破坏。RA的治疗目前仍是一个世界难题，要解决这一难题，病因及发病机制方面的研究是关键。近年来的一些研究表明，RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中及滑膜成纤维细胞中miR-146a的表达存在异常，提示miR-146a可能参与了RA的发病。本研究中进一步检测miR-146a在RA患者尿沉渣中的表达，旨在进一步研究miR-146a在RA发病中的作用。

1　资料与方法

1.1病例选择

本研究中的80例RA患者均为本院2013年至2015年门诊或住院患者，所有入选患者诊断均符合美国风湿病学会（ACR）1987年修订的RA分类标准。80例RA患者中，男11例，女69例；年龄最小21岁，最大72岁，平均（44±17）岁；其中活动期RA患者46例作为A组，非活动期RA患者34例作为B组。另选择本院门诊健康体检者40例作为正常对照组（C组），其中男6例，女34例；年龄最小21岁，最大74岁，平均（45±18）岁。RA患者的关节外表现是指关节炎以外的其他所有临床表现，包括眼部病变、肺部病变、皮肤病变、类风湿结节、血液系统病变等。

1.2试验方法

采集以上研究对象的外周血液标本5 mL，取2 mL抗凝用于血沉（ESR）的测定；另3 mL抗凝用于分离采集血清，以进行临床免疫学及生化项目检测。

收集每例研究对象的清晨中段尿液50 mL，立即在室温、3 000 g/min转速下离心30 min，弃上清液，将尿沉渣用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，转移至1.5 mL EP管内，置4℃离心机中，在130 000 g/min转速下离心5 min，弃去上清，将沉渣放入-80℃冰箱保存，用于提取RNA。

采用Trizol法按说明书提取总RNA，用核酸紫外分析仪检测RNA浓度，保证OD260/280位于1.8～2.0，将RNA冻存于-80℃冰箱中，备用。

采用TaqMan⑧microRNA逆转录试剂盒（ABI公司），反应体系为15 μL，按说明书操作。反应参数设置为：16℃30 min，42℃30min，85℃5 min，然后4℃延伸。选用RUN6为内参照。

采用ABI公司的TaqMan⑧PCR试剂盒，反应体系为20 μL，按说明说操作。反应参数设置为：95℃变性10 min，然后95℃15 s、60℃60 s进行40个循环。引物序列正向为：ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATGGGT；反向为：CTCAACTGGTGTCGTGGA。

1.3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，比较不同组间计量资料差异时行独立t检验，比较不同组间性别差异时采用方差分析，相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有显著性。

2　结果

2.1入选对象一般临床资料

RA患者与正常对照组、活动期RA患者与非活动期RA患者及非活动期RA患者与正常对照组间的年龄、性别差异均无统计学意义（P >0.05），详见表1。

表1　一般临床资料比较

2.2miR-146a的表达

RA患者尿沉渣中miR-146a的表达水平显著高于健康体检者（P＜0.05）。活动期RA患者及尿沉渣中miR-146a的表达水平显著高于非活动期RA患者（P＜0.05），非活动期RA患者尿沉渣中miR-146a的表达水平与健康体检者比较无显著性差异（P >0.05），有关节外表现的RA患者尿沉渣中miR-146a的表达水平显著高于无关节外表现的RA患者（P＜0.05）。详见表2。

表2　入选研究对象miR-146a表达水平的比较（±s）

表2　入选研究对象miR-146a表达水平的比较（±s）

注：*为A + B组与C组相比；#为A组与B组相比；＄为B组与C组相比；**为有关节外表现的RA患者与无关节外表现的RA患者相比。

研究对象RA患者（A +B组）活动期RA患者（A组）非活动期RA患者（B组）健康体检者（C组）有关节外表现的RA患者无关节外表现的RA患者miR-146a表达水平0.71±0.04 0.91±0.05 0.42±0.04 0.17±0.01 1.13±0.12 0.59±0.04 t值8.417-6.901 7.052-5.984 P值0.000*0.005#0.000＄0.000**

2.3miR-146a与RA患者临床表现的相关性

相关性分析结果显示，尿沉渣中miR-146a的表达水平与RA患者的DAS28评分呈正相关性（r=0.675，P＜0.05）、与血沉（ESR）呈正相关性（r=0.657，P＜0.05）、与C-反应蛋白（CRP）水平呈正相关性（r=0.522，P＜0.05），但与病程（r=0.052，P=0.650）、类风湿因子（RF）（r=-0.049，P=0.664）及抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体，r=0.089，P=0.433）的滴度水平无明显相关性（P >0.05）。

3　讨论

microRNA也被称为微小RNA或miRNA，通过与靶mRNA的结合导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而在转录后水平对基因表达进行调控。越来越多的研究发现，microRNA参与了机体细胞的分化、增殖、发育、凋亡及先天性与获得性免疫应答等多种生物学过程，与多种疾病的发生相关，如癌症、糖尿病、心脏病、感染及某些风湿性疾病等，并有可能成为这些疾病的诊断、病情活动性及疗效判断的标记物，甚至成为潜在的治疗靶点［1］。miR-146a由于靶目标相对明确［2-3］，从而在RA发病的研究中备受关注。目前，多项研究已经表明，miR-146a在RA患者中的表达和正常人及骨关节炎（OA）患者相比存在异常，表达异常的部位既包括滑膜及滑膜的成纤维细胞［4-9］，也包括外周血单个核细胞（PBMCs），特别是CD4+T细胞［10-14］。除了表达异常，还发现miR146a在RA中的表达与RA的病情活动性相关［6］。有学者推断其原因可能是，这些患者体内过多表达的的白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症相关细胞因子以NF-KB依赖的方式诱导miR-146a基因转录增加有关［15］。

microRNAs异常表达不仅存在于肿瘤组织、PBMC中，还广泛存在于正常人和不同病种患者的血清、血浆及尿液中，并具有良好的抗RNase降解能力，有较高的稳定性。以上提示尿液中microRNAs可以成为潜在的疾病无创诊断和预后的生物标志物。尿液中miRNA不仅可作为肿瘤的分子标志物，还可用于判断系统性红斑狼疮等其他疾病及妊娠［16-17］。但到目前为止，关于RA患者尿液中microRNAs表达情况及其意义的研究尚未见报道。

为了进一步探讨miR-146a在中国RA患者中的意义，本研究中对80例RA患者（活动期46例，非活动期34例）及40例健康体检者尿沉渣中miR-146a的表达水平进行检测，并分析了其与RA病情活动性及临床表现的相关性。结果显示，RA患者尿沉渣中miR-146a的表达水平显著高于健康体检者，活动期RA患者显著高于非活动期RA患者，非活动期RA患者与健康体检者相比无显著性差异，有关节外表现的RA患者显著高于无关节外表现的RA患者。

总之，本研究中初步探讨了miR-146a在RA中的意义，结果显示miR-146a在RA患者尿沉渣中的表达显著增高，并与RA病情活动度及特定临床表现相关，提示miR-146a可能参与了RA的发病，可能有助于RA的诊断及病情活动性判断。至于miR-146a参与RA发病的具体机制，尚需进一步进行功能方面的研究。

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Expression of miR-146a Detected by Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay in the Urinary Sediment of Patients with Rheumatoid Arthritis and Its Clinical Significance

Hu Qiuxia，Li Bo，Wu Ximei，She Ruonan，Tan Jinhui，Huang Cuiping，Tang Qunfang
（Department of Rheumatology，People′s Hospital of New District Longhua Shenzhen，Shenzhen，Guangdong，China 518109）

Abstract：Objective To explore the expression of miR-146a detected by real-time PCR in the urinary sediment of patients with rheumatoid arthritis（RA），with an attempt to explore its clinical significance in RA.Methods The morning midstream urine of 80 cases of RA patients（46 cases active，34 cases inactive）and 40 cases of healthy controls were collected and the RNA was extracted from the urine sediment.The expression level of miR-146a was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（real time PCR）and the correlation with disease activity in RA and RA clinical manifestations were analyzed.Results The expression level of miR-146a in RA patients was（0.70±0.04），which was significantly higher than（0.17±0.01）in the healthy controls（P＜0.05）.The expression levels of miR-146a in active RA patients was（0.91±0.05），which was higher than（0.42±0.04）in inactive RA patients（P＜0.05）.The expression levels of miR-146a in inactive RA patients was higher than in the healthy controls［（1.17±0.01）vs （0.63±0.04），P＜0.05］.The expression levels of miR-146a in RA patients with extraarticular manifestations was（1.13±0.12），which was higher than in RA patients without extraarticular manifestations（0.59±0.04）（P＜0.05）.The expression level of urinary miR-146a was positively correlated with disease activity score in 28 joints（DAS28）（r=0.675，P＜0.05），ESR（r=0.657，P＜0.05）and CRP（r=0.522，P＜0.05），but not correlated with disease duattion（r=0.052，P=-0.650），RF（r=0.049，P=0.664）and anti-CCP antibodies （r=0.089，P=-0.443）.Conclusion The expression level of urinary miR-146a was significantly higher in RA patients and correlated with some clinical features of RA，indicating that miR-146a may play a role in the pathogenesis of RA.

Key words：miR-146a；rheumatoid arthritis；urinary；rheumatoid factor

中图分类号：R363.2；R593.22

文献标识码：A

文章编号：1006-4931（2016）07-0077-04

作者简介：胡秋侠，安徽阜阳人，大学本科，主管护师，研究方向为常见风湿病和肾脏病的护理，（电子信箱）genefan@163.com；李博，安徽宿州人，在读在职博士研究生，主任医师，研究方向为常见风湿性疾病的发病机制研究，本文通讯作者，（电子信箱）friendlybo@163.com。

收稿日期：（2015-12-01）