高效液相色谱法测定人血清中茶碱浓度
2016-06-07孔幸珊曾彩芳杨佳彬
孔幸珊,曾彩芳,杨佳彬
(广州医科大学附属第四医院,广东广州 511447)
高效液相色谱法测定人血清中茶碱浓度
孔幸珊,曾彩芳,杨佳彬
(广州医科大学附属第四医院,广东广州511447)
摘要:目的建立测定人体内茶碱血药浓度的高效液相色谱(HPLC)法。方法采用10%三氟乙胺沉淀处理血清样品,色谱柱为Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(25∶75),流速1.0 mL/min,紫外检测波长274 nm,柱温25℃。结果茶碱血药浓度在2.55~40.72 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好,回归方程为Y=45 417.2 X-4 580.0,r=0.999 8(n=6)。日内和日间精密度的RSD分别不超过4.88%和6.06%,定量限为0.2 μg/mL。结论该法快速、准确,适用于临床茶碱血药浓度监测。
关键词:茶碱;高效液相色谱法;血药浓度监测
茶碱是黄嘌呤类药物,作为嘌呤受体阻滞剂能抑制磷酸二酯酶活性,松弛支气管平滑肌[1]。其临床主要用于支气管哮喘、阻塞性肺气肿等肺部疾病[2],疗效确切,价格低廉,且不易出现耐受。但茶碱的治疗窗比较窄,临床多种常用药物均能降低茶碱的清除率[3-5],容易出现因血药浓度过高导致的药品不良反应。监测茶碱血药浓度是保证临床安全、合理使用茶碱的重要手段。为此,笔者建立了可快速测定茶碱血药浓度的高效液相色谱(HPLC)法。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1仪器
LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司,包括SIL-20A自动进样器,LC-20AT溶液输送泵,SPD-20A UV-VIS Detector,工作站,柱温箱)。Eppendorf 5424R型台式高速低温离心机;AUW120D型天平(十万分之一,日本岛津公司)。
1.2试药
茶碱对照品(批号为100121-201104,中国食品药品检定研究院);甲醇(色谱纯,MERCK公司);试验用水为去离子水,经0.45 μm滤膜过滤后使用;三氟乙酸,氢氧化钠均为化学纯。健康人空白血浆由本院检验科提供,样品血浆由呼吸科和心血管内科提供。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(25∶75);流速:1.0 mL/min;紫外检测波长:274 nm;柱温:25℃;进样量:20 μL。
2.2溶液配制
将茶碱对照品于105℃下干燥2 h后,精密称取10.18 mg,置10 mL容量瓶中,加甲醇水[甲醇-水(25∶75)]充分溶解,稀释至刻度,得标准贮备液(质量浓度为1.018 g/L),于4℃冰箱中保存备用。
2.3血清样品处理
取空白血清380 μL,加入20 μL标准茶碱溶液,涡旋混合10 s,加10%三氟乙酸150 μL,涡旋2 min,12 000 r/min离心12 min,取上清液400 mL,加入30 μL 1 mol/L NaOH涡旋混合10 s,12 000 r/min离心6 min,取上清液400 μL,进样分析。
2.4方法学考察
专属性试验:按拟订色谱条件分别对对照品溶液、空白血清和茶碱标准品血清进行分析,色谱图见图1。可见,茶碱峰未受血清杂质峰干扰,茶碱的保留时间是5.8min。
图1 血药浓度测定高效液相色谱图
标准曲线与检测限考察:取标准茶碱溶液,制备50.9,101.8,203.6,407.2,610.8,814.4 μg/mL系列质量浓度溶液。取血清380 μL,分别加入20 μL茶碱对照品溶液,得血清药物浓度分别为2.55,5.09,10.18,20.36,30.54,40.72 μg/mL标准血清样品,按2.3项下方法处理,进样分析,记录色谱图,以茶碱峰面积为纵坐标(Y),茶碱质量浓度为横坐标(X)建立标准曲线,得线性回归方程Y=45 417.2 X-4 580.0,r=0.999 8(n=6)。结果表明,茶碱质量浓度在2.55~40.72 μg/mL间与峰面积线性关系良好。以信噪比(S/N)≥3计算最低检测限为0.06 μg/mL,以S/N≥10计算定量限为0.2 μg/mL。
回收率与精密度试验:配制低、中、高3种质量浓度(分别为2.55,10.18,30.54 μg/mL)的含药血清样品,按2.3项下方法操作。日内每种质量浓度平行配制5份,依法测定,以测得质量浓度值与真实值的比表示方法回收率,计算RSD,作为日内精密度;连续测定3 d,计算RSD作为日间精密度。结果见表1和表2。
表1 茶碱的方法回收率试验结果(n=5)
表2 茶碱的日内精密度和日间精密度试验结果(n=5)
2.5临床应用
监测呼吸科及心血管内科服用茶碱缓释片患者的血药浓度,抽血时间为患者连续服用茶碱缓释片5次(当药物浓度达到稳态时),于第6次服药前30 min(谷浓度)抽血。患者茶碱血药浓度为8.17~10.19 μg/mL。其中心血管内科患者同时服用调血脂药瑞舒伐他汀、拜阿司匹林等,呼吸科患者服用阿奇霉素、左氧氟沙星、氨溴索、异丙托溴铵等,所有患者的茶碱血药浓度均未受其他药物影响。结果见图2,表明本法可用于临床药物浓度检测。
图2 临床样品高效液相色谱图
3 讨论
以往报道采用高效液相色谱法测定茶碱血药浓度的文献[6-8]较多,试验中发现,随着流动相中甲醇比例的增大,茶碱的出峰时间缩短。水的极性比甲醇大,茶碱是黄嘌呤结构衍生物,结构中虽然含N—H,但氮原子的孤对电子与相邻的C=N形成p-π共轭,降低了N—H的极性,因此增加流动相中甲醇的比例,体系的极性降低,根据相似相容原理,茶碱的保留时间就相对减少,故出峰时间减短。但出峰时间过短,容易受血浆中的蛋白干扰,而出峰时间过长,监测耗时,浪费溶剂,增加成本;相比甲醇-磷酸盐体系作为流动相[9],以甲醇-水为流动相更简单经济,更能延长色谱柱的使用寿命。故选择甲醇-水(25∶75)作为流动相,茶碱出峰时间为5.8 min,比较合适。
血浆样品处理曾考察经典提取法和蛋白沉淀法,其中经典提取法用乙酸乙酯提取,40℃真空干燥箱干燥,操作复杂,耗时较长,但回收率较高;蛋白沉淀法分别选用甲醇、乙腈和10%三氟乙酸作为沉淀剂,沉淀效果10%三氟乙酸>乙腈>甲醇。故选择10%三氟乙酸作为蛋白沉淀剂处理样品,操作简单,快速。虽然蛋白沉淀法的提取回收率不及提取法,但茶碱血药浓度监测需要的最低检测浓度较高,10%三氟乙酸蛋白沉淀法的最低定量限达0.2 μg/mL,可较好地满足试验要求。
茶碱有效血药浓度的治疗范围是5~20 μg/mL,当药物浓度达到15~20 μg/mL时,个别人群即可发生轻微的毒性反应,其在人体内的药物浓度受年龄[10]、生理病理因素[11]和其他药物的相互作用[1,3]影响,因此建立一个简便的茶碱药物浓度监测的方法辅助临床安全用药十分有意义。本法简单、快速、灵敏、专项性强,分离完全,不受临床用药干扰,可广泛用于临床监测茶碱血药浓度。
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Determination of Serum Theophylline Concentration by HPLC
Kong Xingshan,Zeng Caifang,Yang Jiabin
(The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong,China 511447)
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of theophylline in human plasma.Methods The serum sample was performed the precipitation treatment by 10%trifluoroacetic acid,the chromatographic column was the Inertsil ODS-SP column(250 mm×4.6 mm,5 μm),the mobile phase was consisted of methanol-water(25∶75).The UV detection wavelength was at 274 nm with a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature of 25℃.Results The concentration of theophylline in the range of 2.55-40.72 μg/mL showed good linearity.The regression equation of plasma theophylline concentration and peak area was Y=(45 417.2)X-4 580.0,r=0.999 8(n=6).The intra-day and inter-day RSD were less than 4.88%and 6.06%,and the limit quantitation was 0.2 μg/mL.Conclusion The established method is fast,accurate and suitable for therapeutic dug monitoring (TDM)of theophylline in clinical.
Key words:theophylline;HPLC;TDM
中图分类号:R969.1;R974+.3
文献标识码:A
文章编号:1006-4931(2016)07-0030-03
作者简介:孔幸珊(1987-),女,广东广州人,硕士研究生,药师,主要从事临床药学工作,(电话)020-39195632(电子信箱)kongxingshan@126.com;杨佳彬(1981-),男,广东广州人,大学本科,主管药师,主要从事临床药学工作,本文通讯作者,(电话)020-39195632(电子信箱)nfyyyjb@126.com。
收稿日期:(2015-09-27)