金丝桃苷、淫羊藿苷在大鼠附睾精子冷冻保存中的作用＊

盛文洁，聂晓伟，谈 勇，陈 娟，刘承勇

（1.南京中医药大学附属医院生殖医学科 南京 210029；2.南京中医药大学第一临床医学院 南京 210023）

金丝桃苷、淫羊藿苷在大鼠附睾精子冷冻保存中的作用＊

盛文洁1,2，聂晓伟1＊＊，谈 勇1,2，陈 娟1，刘承勇1

（1.南京中医药大学附属医院生殖医学科 南京 210029；2.南京中医药大学第一临床医学院 南京 210023）

目的：本研究旨在观察金丝桃苷、淫羊藿苷在大鼠精液冷冻保存过程中的应用效果，并对大鼠精液冷冻保存体系进行优化。方法：将金丝桃苷、淫羊藿苷加入大鼠精液冷冻保护 剂中，冷冻保存大鼠附睾尾部的精 子，并评估冷冻前后精子活率指数，采用伊红染色评估精子畸形率。结果：添加金丝桃苷、淫羊藿苷的冷冻保护剂可以提高解冻后的精子活率指数。结论：金丝桃苷、淫羊藿苷在大鼠精液冷冻保存过程中有一定的保护作用。

金丝桃苷 淫羊藿苷 大鼠 附睾精子 冷冻保存

近年来，随着环境、饮食、遗传等因素的影响，男性少弱精症患病率呈现逐年升高的趋势，大部分原因不明，可归属于特发性少弱精症，西医一般以经验治疗为主，而中医中药特色辨证治疗，发挥了中医学的优势，获得满意的效果。中药治疗以补肾为主[1]，菟丝子与淫羊藿均是临床常用的补肾中药。我们前期研究结果显示在大鼠常用的精液冷冻保护液配方中添加菟丝子、淫羊藿水提液，可以提高解冻后精子活率指数（Sperm Motility Index，SMI）。故在大鼠精液冷冻保存时添加菟丝子、淫羊藿水提液，对于大鼠精液具有保护作用[2]，但是关于其机制的研究比较少。

多年临床实践证明，少弱精患者的精液通过冷冻保存的方式，经过处理后会得到更多的处理后活动精子总数（Processed Total Motile Sperm， PTMS），并应用于宫腔内人工授精（Intrauterine Insemination，IUI）。通过提高PTMS，可以使更多患者能够通过IUI治疗成功妊娠，从而显著降低患者辅助生殖治疗费用[3]。然而，临床治疗中使用商品化的人类精液冷冻保存系统在保存正常精液时更有优势，对少弱精的保存效果较差[4]。2009年底出版的WHO《第五版人类精液分析与处理实验室手册》 首次单独列出一个章节论述精液冷冻的标准化流程，提到了少弱精的冷冻保护剂的特殊性，少弱精的冷冻保存已经引起了国内外专家的重视[5]，但目前对于适用于少弱精的新型冷冻保护剂缺乏系统的研究，特别是针对添加中草药成分的效用研究甚少。金丝桃苷、淫羊藿苷分别是中药菟丝子、淫羊藿在药理研究中得到确认的有效成分[6,7]，故在前期研究基础上，我们将金丝桃苷、淫羊藿苷添加到大鼠精液冷冻保存体系中，探讨其在大鼠精液冷冻保存过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验选择清洁级SD雄性大鼠10只，15周龄，体质量380-480 g，取附睾精子用于冷冻保存研究。实验动物由南京医科大学实验动物 中心提供。

1.2 材料与方法

1.2.1 材料

金丝桃苷（中国食品药品检定研究院，批号: 110737-200415）；淫羊藿苷（中国食品药品检定研究院，批号: 111521-201205）。

1.2.2 稀释液的配置

Tris碱375.0 mmoL·L-1（51.11 mg·mL-1），葡萄糖41.0 mmoL·L-1（8.12 mg·mL-1），枸橼酸124.0 mmoL·L-1（26.06 mg·mL-1）。50 mL稀释液中含Tris碱2.555 5 g、葡萄糖0.406 g、枸橼酸1.303 g。最终混合成375.0 mmoL·L-1Tris缓冲液（pH 7.0，渗透压375 mOsm）。

1.2.3 冷冻基础液的配置

自行配置mKRB培养液：氯化钙（结晶）1.71 mM，氯化钾4.78 mM，硫酸镁（7水结晶）1.19 mM，磷酸二氢钾1.19 mM，氯化钠94.6 mM，葡萄糖5.56 mM，碳酸氢钠25.07 mM，丙酮酸钠0.5 mM，乳酸钠21.58 mM，链霉素50 μg·mL-1+青霉素75 μg·mL-1。

于mKRB培养液中一次性加入0.05% SDS、0.1M棉子糖和20.0%卵黄。在基础液中加入卵黄后，混匀30 min，6 000 rpm离心30 min，弃沉淀，上清液6 000 rpm离心30 min， HCl调整pH值为7.3，通过0.45 μm的滤膜进行过滤，低温保存。

1.2.4 实验分组

实验Ⅰ：在配置的基础液中，对照组命名为C1，实验组分别加入浓度为1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的金丝桃苷，分别命名为T1、T2、T3、T4、T5、T6。

实验Ⅱ：在配置的冷冻基础液中，对照组命名为C2，实验组分别加入浓度为0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1的淫羊藿苷，分别命名为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。

各组冷冻保护剂均需通过0.22 μm的滤器过滤，低温保存备用。

1.2.5 附睾尾部精子的获取与稀释

预先配制10%水合氯醛，2 mL/只腹腔注射麻醉大鼠,打开腹腔，游离附睾尾，吸取2 mL稀释液置于353037皿中，将附睾尾浸入皿中，计数附睾尾部浆液的精子密度（N）及精子活率（SMI）。用稀释液、Makler计数板进行密度调整，将精子密度调整为2 000万/mL备用。

1.2.6 装管

将冷冻液与大鼠精液按1:1，1:2（体积比）混合后，分装于冷冻管中。将冷冻液与大鼠精液按1:2混合后,分装于冷冻麦管中。

1.2.7 冷冻与解冻

冷冻各组冷冻管、麦管前均需4℃预冷平衡30 min，然后于液氮蒸汽（距液氮表面1-2 cm）中熏蒸10 min，最后 置于液氮中冷冻。从液氮中 取出冷冻麦管，静置于37℃水浴中10 s，将冻存精液转移至353037皿中，把培养皿放置于37℃培养箱中，10 min后检测解冻后精子的SMI、SDI。从液氮中取出冷冻管，静置于37℃水浴中10 min，待完全解冻后检测解冻后精子的SMI、精子畸形率（Sperm Deformity Index，SDI）。

1.2.8 精子活率指数（SMI）测定

取1滴精液于载玻片表面,加载盖玻片,置于高倍镜下观察并记录前向活动精子数、活动精子数。SMI的计算公式：SMI=[活动精子数+（前向活动精子数×20）/2]%。

1.2.9 精子畸形率（SDI）测定

于清洁载玻片上分别滴取冷冻前和解冻后的大鼠精子悬液，做均匀推片之后，将玻片用无水乙醇固定10 min，2%伊红水溶液染色30 min，再于高倍镜下检查每只大鼠500个完整精子，记录正常精子数，无钩、胖头、断头的头部畸形精子数，以及双尾、断尾、尾折叠的尾部畸形精子数。

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 不同混合比例对大鼠精液冷冻保存效果的影响

实验Ⅰ中，各组冷冻管按体积比1:1与1:2进行混合，结果表明，大鼠精液与冷冻保护液按1:2的比例混合与1:1比例混合相比较，解冻后SMI升高，但同组两者间无显著性差异（见表1）；随着金丝桃苷添加浓度的提高，解冻后SDI有升高的趋势。实验Ⅰ证明，在添加金丝桃苷的冷冻保护剂中，大鼠精液与冷冻保护剂以1:2的比例混合冻存精子的效果更好，其中T4组解冻后SMI最高。

实验Ⅱ中，各组冷冻管按体积比1:1与1:2进行混合，结果表明，大鼠精液与冷冻保护液按1:2的比例混合与1:1比例混合相比较，解冻后SMI升高，但同组两者间无显著性差异（见表2）；随着淫羊藿苷添加浓度的提高，解冻后SDI有升高的趋势。实验Ⅱ证明，在添加淫羊藿苷的冷冻保护剂中，大鼠精液与冷冻保护剂以1:2的比例混合冷冻效果更好。

2.2 不同冷冻介质对精液冷冻保存效果的影响

实验Ⅰ中，各组使用麦管和冷冻管按体积比1:2进行混合，结果表明麦管冷冻效果明显优于冷冻管,其中T2、T3、T4组两者间有显著性差异（P＜0.05）；不同组麦管之间比较差异显著（P＜0.05）；随着金丝桃苷添加浓度的提高，解冻后SDI有升高的趋势。实验Ⅰ证明，在添加金丝桃苷的冷冻保护剂中，麦管冷冻效果明显优于冷冻管。

实验Ⅱ中，各组使用麦管和冷冻管按体积比1:2进行混合，结果表明麦管冷冻效果明显优于冷冻管，同组两者间有显著性差异（P＜0.05）；不同组麦管之间比较差异显著（P＜0.05）；随着淫羊藿苷添加浓度的提高，解冻后SDI有升高趋势。实验Ⅱ证明，在添加淫羊藿苷的冷冻保护剂中，麦管冷冻效果明显优于冷冻管。

3 金丝桃苷、淫羊藿苷最佳添加浓度的确定

实验Ⅰ中，T4组解冻后SMI最高，解冻后SMI达到27.63%，即添加50 μg·L-1金丝桃苷的冷冻保护剂解冻后SMI最高，与其他组相比差异极显著；实验Ⅱ中，Y4组解冻后SMI最高，即添加20.0 μg·L-1淫羊藿苷的冷冻保护剂解冻后SMI最高，与其他组相比有显著性差异。

表2 添加淫羊藿苷的冷冻保护剂冷冻效果比较

3 讨论

多年临床实践证明中医药治疗少弱精可以明显改善患者精子质量。研究发现菟丝子水煎剂对人精子的运动功能和膜功能有明显促进作用，菟丝子可能在治疗男性不育[8]中有一定的疗效，并且可能在辅助生殖过程中提高IUI的成功率[9]。雷公藤多苷可导致的生精细胞损伤、凋亡可由菟丝子黄酮缓解[10]，且菟丝子黄酮能通过对表皮生长因子mRNA、蛋白表达量的提高而对雷公藤多苷所导致雄性幼鼠的生殖损伤起保护作用[11]。菟丝子醇提物能显著促进未成年小鼠睾丸以及附睾的发育，显示其可能具有促性腺激素的类似作用，在离体培养大鼠睾丸间质细胞实验中，可与人绒毛膜促性腺激素起协同作用，促使大鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌增加，显示其可在下丘脑-垂体-性腺轴的不同环节起作用来对机体的生殖内分泌活动进行调整。最新研究表明，淫羊藿、菟丝子等中药应用于冷冻保存人、猪精液有一定优化效果，推测其机理可能是多种化学成分协同作用的结果，可能通过改变精子细胞膜结构中的各种成分（磷脂、胆固醇等）的含量或者比例起优化作用；也可能通过溶解磷脂改变了精子膜的流动性,使膜脂的有效性得到保护,并且使精子细胞的通透性得到改善,从而使精子在冻存过程中减少低温损伤的风险[12,13]；亦可能其适宜浓度可对抗活性氧[14]对正常精子所造成的膜、顶体结构及线粒体[15]的损伤，并且可显著提高精子悬液超氧化物歧化酶的活力，同时降低丙二醛含量，且其抗氧化作用为通过干预ROS对精子膜脂质进行过氧化反应[16-18]。

本次实验发现，随着金丝桃苷、淫羊藿苷添加浓度的提高，解冻后SDI亦有升高的趋势，其原因可能是大鼠精子结构与其他哺乳动物相比有很大差异，比如大鼠精子有狭小而细长的镰刀状头部及更为细长的尾巴[19,20]，所以决定了大鼠精子对如物理损伤、pH值变化、渗透压变化、温度变化等一系列环境变化[21，22]极其敏感。在金丝桃苷、淫羊藿苷的体内药代动力学研究发现，金丝桃苷、淫羊藿苷剂量的增加并不能明显提高血药浓度,而且吸收情况较差,可能主要是由于高剂量对药物溶解度显著降低所导致[23,24]，故推测高浓度金丝桃苷、淫羊藿苷在精子冷冻过程中亦无保护作用，造成解冻后畸形率增高。而各组解冻后SDI与SMI相比较，精子的活动力与畸形精子率之间呈明显负相关，与高媛等[25]的研究结果相一致。大鼠精子与其他哺乳动物精子冷冻保存体系存在显著差异，主要是由于大鼠精子质膜上脂质的含量和成分不同[26]，使大鼠精子冷冻难度更大，有实验研究将大鼠、小鼠和人类精子分别在人类精子低渗肿胀检测液中孵育30 min后的变化进行比较，观察发现人类精子和小鼠精子尾部均出现尾间不同程度的弯曲肿胀或完全肿胀，小鼠精子与人类精子的变化相似，而大鼠精子尾部未出现任何弯曲或肿胀现象[27]。Hammerstedt R. H.等[28]的研究比较了多种生物的精子质膜的磷脂成分，发现大鼠精子细胞膜的成分具有特异性，这种特异性可能增加了大鼠精子的冷冻难度。大鼠作为一种广泛应用于很多研究领域的实验动物，更需要建立一套完善的冷冻精子保存体系以应对日益增多的人类疾病模型。目前对于大鼠精子冷冻体系的研究还不完善，今后将进一步对大鼠精子细胞生物膜结构进行探索，并对生物学机理进行研究，可能研发出适用于大鼠精子的完整冷冻体系。

通过该课题的研究我们已经证明添加一定浓度的淫羊藿苷或金丝桃苷的冷冻保护剂可以有效提高大鼠精液冷冻保存效果。添加50 μg·L-1金丝桃苷的大鼠精液冷冻保护剂解冻后SMI可以达到27.0%以上。这一证据表明中药单体成分的添加可能有改善大鼠精液冷冻保存效果。在今后的科研工作中，我们希望能够将更多的中药单体有效成分用于人精液冷冻保存研究，最终研发适用于少弱精患者的新型冷冻保护剂。

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Effect of Hyperoside and Icariin on Rat Epididymal Sperm Cryopreservation

Sheng Wenjie1,2, Nie Xiaowei1, Tan Yong1,2, Chen Juan1, Liu Chengyong1
(1. Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China; 2. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

This study was aimed to observe the effects of hyperoside and icariin on the cryopreservation of rat epididymal sperm and optimize the cryopreservation system. Hyperoside and icariin were added to rat semen cryoprotectant when rat epididymal sperm was cryopreserved. Sperm motility index (SMI) before and after cryopreservation was evaluated and sperm deformity index (SDI) was evaluated by hematoxylin-eosin staining. The results showed that adding hyperoside and icariin to rat semen cryoprotectant can improve the SMI after the sperm was thawed. It was concluded that hyperoside and icariin can protect rat epididymal sperm in the process of rat epididymal sperm cryopreservation.

Hyperoside, icariin, rat, epididymal sperm, cryopreservation

10.11842/wst.2016.03.022

R698

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：王 晶）

2015-09-24

修回日期：2015-01-04

＊ 国家自然科学基金委青年科学基金项目（81403426）补肾促排卵中药对DOR小鼠雄原核及早期胚胎去甲基化的影响及作用机制研究，负责人：聂晓伟；江苏省中医院院内课题资助项目(Y14017)：补肾活血中药及其有效成分对胚泡着床障碍大鼠子宫内膜的影响，负责人：聂晓伟；江苏省组织部、江苏省人力资源和社会保障厅、江苏省财政厅“六大人才高峰”第十二批高层次人才资助项目（WSN-05）：中药有效成分在少弱精冷冻保存及配子体外受精中的应用，负责人：聂晓伟；江苏省教育厅2015年江苏高校优秀科技创新团队资助项目，负责人：谈勇。

＊＊ 通讯作者：聂晓伟，助理研究员，主要研究方向：生殖医学和生殖生物学。