SIRT3在食管鳞癌中的表达及作用机制

刘 琼， 何 斌， 任丽华， 邱洪清

张家港市第一人民医院(苏州大学附属医院张家港医院)，江苏 张家港 215600

SIRT3在食管鳞癌中的表达及作用机制

刘 琼， 何 斌， 任丽华， 邱洪清

张家港市第一人民医院(苏州大学附属医院张家港医院)，江苏 张家港 215600

目的 探讨SIRT3在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表达及其相关作用机制，为ESCC的早期诊断提供依据。方法 收集ESCC患者癌组织、正常食管组织标本各20例，免疫组化(IHC)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组标本中SIRT3的表达；Western blotting检测ESCC细胞株Eca109在常氧、缺氧(6 h、12 h、24 h)状态下SIRT3、HIF-1α蛋白的表达。结果 SIRT3蛋白在ESCC组织中的表达水平高于正常食管组织，差异有统计学意义(0.51±0.06vs0.26±0.04，P<0.05)；缺氧状态下Eca109细胞中SIRT3表达水平降低，HIF-1α表达水平升高。结论 SIRT3的高表达可能与ESCC的发生、发展有关；HIF-1α对ESCC的发生、发展有促进作用，对其表达的检测可能会成为ESCC的早期诊断手段之一。

SIRT3；食管鳞癌；能量代谢

SIRT3(sirtuin3)为沉默信息调节因子2(Sir2)家族成员之一，大部分位于线粒体内膜，具有去乙酰基酶活性。SIRT3被认为是调节能量平衡的关键，其表达量的高低影响线粒体功能，进而造成细胞能量代谢、有丝分裂等方面出现异常[1]。目前SIRT3在肿瘤中的作用尚存在争议[2]，其在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表达及作用机制仍不清楚。本研究通过免疫组化(IHC)和蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测SIRT3在ESCC组织中的表达情况，并初步探讨SIRT3在ESCC细胞中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集苏州大学附属张家港市第一人民医院2013年9月-2014年10月ESCC患者手术切除标本，ESCC组织20例，配对正常食管组织20例。上述标本中男14例，女6例，年龄40～75岁，平均年龄(55.3±11.8)岁。所有病例均经病理证实为ESCC，且术前均未经放疗、化疗及其他治疗。

1.2 细胞培养ESCC细胞株Eca109(购自上海细胞研究所)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。缺氧培养即将细胞置于缺氧培养箱(1% O2、5% CO2、94% N2)中培养，根据实验需求给予不同的缺氧时间。

1.3 主要试剂兔抗鼠SIRT3单克隆抗体(货号2627)购自美国Cell Signaling公司，生物素标记羊抗兔IgG购自北京碧云天公司，GAPDH内参购自美国Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 IHC方法：蜡块包埋组织制作切片(4 μm厚度)。切片常规脱蜡、水化，3% H2O2浸泡。经DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS缓冲液代替抗体为阴性对照，免疫组化染色有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性表达。每张标本切片随机选择5个区域进行拍照，利用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析系统测量阳性细胞平均光密度值，并进行半定量统计分析。

1.4.2 Western blotting：常规提取细胞蛋白,取50 g蛋白行10% SDS-PAGE电泳后转膜，加5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后，加入SIRT3、HIF-1α一抗(稀释浓度均为1∶1 000)后4 ℃摇床过夜，加入HRP标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗膜，曝光，显影。以GAPDH(工作浓度1∶3 000)作为内参照。

2 结果

2.1 IHC检测SIRT3在ESCC组织中的表达IHC染色结果显示:SIRT3主要表达于ESCC组织的基底层，以细胞质内多见。半定量分析结果显示:ESCC组织中SIRT3蛋白表达量较正常食管组织升高(0.51±0.06vs0.26±0.04)，差异有统计学意义(P=0.02，见图1)。

2.2 Western blotting检测SIRT3在ESCC组织中的表达Western blotting检测SIRT3在3对ESCC组织及正常食管组织中的表达，结果显示:SIRT3蛋白在ESCC组织中的表达量(2.43±0.30)较正常食管组织(1.06±0.05)高，差异有统计学意义(P=0.01，见图2)。

图1 IHC检测SIRT3在ESCC组织及正常食管组织中的表达(200×) A：ESCC组织；B：正常食管组织

注：1～3：正常食管组织; 4～6：ESCC组织。

2.3 Western blotting检测常氧及缺氧条件下SIRT3、HIF-1α在Eca109中的表达常氧环境下Eca109细胞中SIRT3的相对表达量为1.08±0.06，而缺氧6 h、12 h、24 h后Eca109细胞中SIRT3的相对表达量分别为0.86±0.02、0.71±0.03、0.51±0.03，四组之间比较，差异有统计学意义(P<0.0001)。常氧环境下Eca109细胞中HIF-1α的相对表达量为1.07±0.03，而缺氧6 h、12 h、24 h的Eca109细胞中HIF-1α的相对表达量分别为1.14±0.05、1.27±0.06、1.51±0.03，四组之间比较，差异有统计学意义(P<0.0001，见图3)。

注：1：常氧；2：缺氧6 h；3：缺氧12 h；4：缺氧24 h。

3 讨论

肿瘤细胞能量代谢一直是肿瘤研究的热点之一，其中“Warburg效应”的提出是一个里程碑，它的主要观点是肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下依然优先选择糖酵解进行能量代谢，而不是采用产生ATP效率高的线粒体有氧氧化[3]。缺氧诱导因子HIF-1α是该效应中较重要的因子之一，在缺氧条件下其与芳香烃受体核转位蛋白结合，进一步转位至核内，与缺氧反应元件相结合，传递肿瘤相关代谢信号，被认为是一个促癌基因[3-4]。SIRT家族是NAD依赖性蛋白，SIRT1、6、7分布于细胞核，SIRT2分布于细胞质，而SIRT3～5分布于线粒体。其中SIRT3作为线粒体的脱乙酰酶可作用于脂肪氧化、氨基酸代谢、电子传递链等[5]。鉴于肿瘤目前越来越多地被定义为代谢疾病，而线粒体又处于代谢的中心地位，SIRT3作为线粒体内主要的去乙酰化酶，则必然与肿瘤代谢有一定的联系[6]。

有研究认为SIRT3在乳腺癌细胞[7]、口腔鳞癌细胞[8]中高表达，且SIRT3高表达致肿瘤细胞增殖速度加快，凋亡受限，细胞中活性氧(ROS)生成增多，细胞呈高糖酵解低有氧氧化状态。也有研究认为SIRT3是一抑癌基因，因发现SIRT3-/-MEF细胞内ROS生成增多，而SIRT3过表达可以抑制ROS生成，这一过程可能是通过调节氧化磷酸化蛋白而发挥作用的[5]。Finley等[9]认为SIRT3缺失可以通过抑制脯氨酰羟基化酶来抑制HIF-1α降解，而这种作用是依赖于细胞内增多的ROS来产生的，HIF-1α可以增强糖酵解，因此SIRT3缺失的肿瘤细胞可以通过HIF-1α表达的增加来调节细胞糖酵解水平。

国内学者对HIF-1α和ESCC糖酵解的关系进行了深入研究，发现缺氧条件下ESCC细胞糖酵解能力增强，这与HIF-1α及糖酵解酶类表达增加与活化有关[10]，而ESCC细胞线粒体有氧氧化方面的作用尚未见有相关研究，故本课题组对SIRT3在ESCC中的作用及HIF-1α、SIRT3在ESCC细胞之间的关系进行初步研究，力图进一步探讨“Warburg效应”在ESCC细胞中的作用。

本研究利用IHC及Western blotting验证了SIRT3在ESCC组织中的表达高于正常食管组织，初步认为SIRT3在ESCC的发生、发展中起促癌基因的作用。有研究认为SIRT3增高的ESCC患者的预后不良，这与我们的研究结果相符[11]。此外，我们进一步通过细胞实验验证了常氧条件下SIRT3在ESCC细胞Eca109中的表达量较缺氧条件下的表达量高，表明缺氧环境可能会引起ESCC细胞SIRT3蛋白的表达缺失，而此时Eca109细胞中HIF-1α的表达水平反而升高，与SIRT3的表达趋势相反，由此我们初步认为SIRT3降低的Eca109细胞可能通过HIF-1α表达的增加来调节肿瘤细胞糖酵解水平，这也与Finley等[9]的研究结果相符，但具体的作用机制尚需进一步研究。

总之，该研究初步提示SIRT3在ESCC组织中的表达量较高，其与HIF-1α在ESCC细胞糖酵解的过程中有重要作用，对其表达的检测可能会成为ESCC的早期诊断手段之一。

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(责任编辑：陈香宇)

Expression and mechanism of SIRT3 in esophageal squamous cell carcinoma

LIU Qiong, HE Bin, REN Lihua, QIU Hongqing

Department of Gastroenterology, Zhangjiagang First People’s Hospital, Affiliated Hospital of Soochow University, Zhangjiagang 215600, China

Objective To investigate the expression and the mechanism of SIRT3 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), and provide the early diagnosis and therapy of ESCC. Methods Twenty ESCC tissues and normal esophageal tissues were collected, the expression of SIRT3 was detected by immunohistochemistry (IHC)and Western blotting assay. The expressions of SIRT3 and HIF-1α in ESCC cell line Eca109 were detected by Western blotting under normoxia condition and hypoxia condition (6 hours, 12 hours, 24 hours). Results The expression of SIRT3 protein in ESCC was higher than that of normal esophageal tissues (0.51±0.06vs0.26±0.04,P<0.05). The expression of SIRT3 in Eca109 cells was reduced in hypoxia condition while the expression of HIF-1α was increased. Conclusion High expression of SIRT3 may affect the occurrence and development of ESCC, HIF-1α has a promoting effect on the occurrence and development of ESCC, and detection of expression may be useful for early diagnosis of ESCC.

SIRT3; Esophageal squamous cell carcinoma; Energy metabolism

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.018

刘琼，主治医师，研究方向：消化系统疾病。E-mail：37891106@qq.com

邱洪清，副主任医师，研究方向：消化系统疾病。E-mail：13338031123@189.cn

R735.1

A

1006-5709(2016)01-0067-03

2015-02-04