肠屏障功能障碍及cingulin、claudin-2表达变化在溃疡性结肠炎中的作用

陈思羽，黄会云，陈 玉，平 倩，张 涛

1. 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，广西 南宁 530011； 2. 广西中医药大学

论著·溃疡性结肠炎

肠屏障功能障碍及cingulin、claudin-2表达变化在溃疡性结肠炎中的作用

陈思羽1，黄会云1，陈 玉2，平 倩2，张 涛1

1. 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，广西 南宁 530011； 2. 广西中医药大学

目的 通过检测溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)结肠黏膜组织形态学、超微结构变化及结肠黏膜扣带蛋白(cingulin)、claudin-2表达，探讨UC发病的可能机制。方法 40只清洁级雄性Balb-c小鼠随机分为2组，其中正常组10只，模型组30只。除正常组外，模型组采用自由应用DSS法制备UC模型，于第8周末处死全部小鼠。应用光镜及透射电镜观察结肠黏膜组织形态学、超微结构及上皮黏膜屏障变化；应用AB-PAS及HID-AB染色观察结肠黏蛋白变化；应用Real-time PCR技术检测结肠黏膜cingulin、claudin-2表达。结果 模型组光镜下见结肠黏膜不同程度缺损、溃疡形成，表面可见坏死组织及隐窝脓肿形成；电镜下见肠上皮细胞表面微绒毛稀疏，细胞连接间隙增宽，杯状细胞减少，线粒体肿胀，结构不清或呈空泡样变，部分可见核固缩，并见凋亡小体。模型组结肠黏蛋白表达明显较正常组减少，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组cingulin、claudin-2表达分别为2.32±0.47、2.41±0.65，与正常组比较，其表达呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 cingulin通过促进claudin-2表达上升，破坏肠黏膜屏障完整，增加肠黏膜通透性导致结肠黏膜免疫反应异常，可能在UC发病中占据重要地位。

扣带蛋白；Claudin-2；紧密连接；肠黏膜屏障；溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是指基因易患基础下，肠道细菌和环境因素共作用下，肠道黏膜免疫应答异常，破坏肠黏膜屏障完整，导致靶器官肠黏膜损伤、甚至溃疡[1]。我们的前期研究发现UC同时存在结肠黏膜上皮细胞凋亡加速和炎性细胞凋亡延缓的病理特点，其中肠黏膜屏障完整性对于维持机体健康、防止组织损伤至关重要，而肠黏膜机械屏障是维持肠黏膜完整性的关键因素[2-3]。显然，促进肠黏膜修复，维持肠黏膜屏障完整已是UC治疗的新靶点和新目标。最近研究发现，反应性氧活性物质(reactive oxygen species，ROS)产生增加，释放大量炎性介质，破坏肠道紧密连接是肠道炎症反应链的第一步，那么在ROS刺激作用下肠道紧密连接蛋白claudin家族、ZO-1蛋白是如何发生变化的呢[4]？扣带蛋白(cingulin)在调控claudin-2、claudin-6表达参与维持肠黏膜屏障性中的作用与UC发病是否存在关联[5]？本课题拟应用自由饮用DSS法制备UC模型，通过观察cingulin、claudin-2、结肠黏膜超微结构及结肠黏蛋白表达变化，探讨其在UC发病中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物Balb-c小鼠40只，SPF级雄性，5周龄，体质量(18±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，动物许可证号SCXK(湘)2011-0003，动物合格证号：4304701479。其中正常组10只，模型组30只。

1.2 主要试剂葡聚糖硫酸钠(DSS，货号D8902)购自美国Sigma公司，2.5%戊二醛、中性甲醛、无水乙醇等均由广州科宏生物技术公司提供，总RNA提取试剂盒、引物合成均由广州蓝吉生物技术公司完成。逆转录试剂盒、RNA酶抑制剂由上海玉森生物技术公司提供。

1.3 主要仪器倒置相差显微镜(德国蔡司)、日本日立H-600透射电镜、BIO-RAD-全自动酶标仪、ABI7500荧光PCR仪、5810R-高速低温离心机等均由广州蓝吉生物技术公司提供。

1.4 方法

1.4.1 造模方法：参照文献[6]报道，所有小鼠适应性喂养1周，正常组继续适应性喂养，模型组小鼠均采用5% DSS自由饮用法连续喂养6周，继而给予正常饮水，于第8周末处死全部小鼠(期间模型组小鼠死亡4只，解剖证实肠胀气穿孔死亡)。详细记录小鼠耗食量、大便性状等变化。

1.4.2 标本采集：全部小鼠于第8周末脱椎处死，截取从回盲部到直肠的全部肠段，在放大镜下观察结肠黏膜组织损伤情况，选取溃疡或糜烂最明确处，沿纵轴切开，置于10%中性甲醛中待测，剩余部分置于超低温冰箱中备用。

1.5 指标检测

1.5.1 UC小鼠结肠黏膜病理学改变：将已用甲醛固定好的小鼠结肠取出，然后切取病变处，经蒸馏水冲洗后逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片，常规HE染色，封片，光镜下观察病理情况。

1.5.2 UC小鼠结肠黏膜超微结构及上皮屏障变化：电镜固定液固定新鲜结肠组织，常规包埋、铀染、超薄切片、H-600透射电镜下观察超微结构变化及肠上皮屏障变化。

1.5.3 UC小鼠结肠黏膜黏蛋白表达变化：采用特殊染色即奥辛兰-过碘酸-雪夫氏(AB-PAS)和高铁双胺-奥辛兰(HID-AB)，严格按实验步骤进行，应用Image Pro-plus 5.0软件分析结肠黏蛋白表达变化。

1.5.4 UC小鼠结肠cingulin、claudin-2表达变化：应用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)，以GADPH为内参，检测cingulin、claudin-2 mRNA表达，具体步骤严格按照试剂说明书进行操作，以目的基因与GAPDH mRNA比值，作为目的基因的相对表达量。cingulin、claudin-2、GADPH引物序列见表1。

表1 cingulin、claudin-2、GADPH引物序列

注：在Gen Bank上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况变化正常组小鼠呈自然增长，无死亡现象；模型组小鼠造模期间分别于第2周、第4周各死亡2只，自第2周起出现大便带黏液、血便，粪质偏稀，耗食量较正常组下降，但未能详细记录并统计分析。

2.2 各组小鼠结肠黏膜组织病理学变化正常组：小鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，个别可见少许炎性细胞浸润；模型组：结肠黏膜不同程度缺损，表面渗出及坏死组织，溃疡未累及黏膜肌层，并见隐窝结构扭曲、隐窝脓肿形成，大量炎性细胞浸润及黏膜下层充血肿胀(见图1)。

2.3 各组小鼠结肠黏膜超微结构及上皮屏障变化正常组：肠上皮屏障完整，微绒毛形态规则、排列整齐，较多杯状细胞，线粒体丰富，嵴结构清晰，粗面内质网未见改变，未见上皮细胞凋亡小体；模型组：肠上皮细胞表面微绒毛稀疏，长短不一，形态不规则，细胞连接间隙增宽，杯状细胞减少，胞浆内有空泡，线粒体肿胀，结构不清，部分嵴消失，个别内质网扩张，或呈空泡样改变，部分可见核固缩，并见凋亡小体(见图2)。

图2 小鼠结肠黏膜超微结构及上皮屏障变化(10 000×) A：正常组；B：模型组

2.4 各组小鼠结肠黏蛋白表达变化模型组结肠黏蛋白表达较正常组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

2.5 各组小鼠cingulin、claudin-2表达变化模型组cingulin、claudin-2表达上调，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

图3 小鼠结肠黏蛋白表达(100×) A：正常组(AB-PAS染色)；B：模型组(AB-PAS染色)；C：正常组(HID-AB染色)；D：模型组(HID-AB染色)

表2 小鼠结肠cingulin、claudin-2表达

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

前期我们研究发现，UC存在肠上皮细胞凋亡加速，肠黏膜屏障破坏的病理学特点[7]，但是肠上皮细胞凋亡加速的原因是否与上皮细胞脱落离开细胞外基质，失去黏附环境所致失巢凋亡相关？或是肠黏膜屏障破坏尤其是调控紧密连接蛋白表达异常，造成食物抗原不停刺激肠上皮细胞导致凋亡加速有关[8-9]？肠黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物学屏障，其中最为重要的是机械屏障。肠黏膜机械屏障主要是由上皮紧密连接而实现的，肠上皮细胞紧密连接是一种选择性屏障，其功能完整依赖于健康的上皮细胞核正常功能的细胞旁路的存在。生理情况下，肠上皮细胞通过不断更新、增殖维持肠道功能完整，而维持该功能完整必不可缺少的主要结构之一是细胞骨架。细胞骨架是细胞内一种复杂的丝状蛋白结构，遍布于细胞浆内，是维持肠道上皮细胞的正常结构、转运和功能完整性不可或缺的，因此细胞骨架是维持肠黏膜屏障功能的一个关键结构，它包括三种蛋白丝：肌动蛋白、微管和中间丝[10]。扣带蛋白(cingulin/CGN)是分子量为140 KDa的蛋白，位于紧密连接的细胞质区域，通过与多种紧密连接蛋白包括ZO-1、ZO-2、ZO-3及肌动蛋白、肌球蛋白结合可能是维持紧密连接完整的重要机制之一[11]。研究表明，cingulin通过RhoA信号刺激，调控紧密蛋白如claudin-2、claudin-6、claudin-7及occulidin表达，而cingulin基因沉默后，明显导致上述蛋白表达下降[12]。本课题发现，UC小鼠结肠cingulin蛋白表达上升，且该表达与UC结肠黏膜组织损伤呈正相关。

UC患者肠道黏膜上皮中，紧密连接蛋白结构和功能也在发生改变，紧密连接蛋白广泛分布于上皮、内皮、间皮细胞膜上，在细胞间组成分子屏障调节分子和离子在细胞间隙的弥散[13]。同时还能够有效分隔细胞顶端和细胞其他部分，从而防止膜蛋白相互混合。另外，它们在细胞极性形成及细胞黏附方面同样发挥重要作用。紧密连接蛋白构成的分子屏障是固有免疫的主要组成部分，能够有效地阻止病原微生物透过上皮细胞层引起疾病[14]。研究表明，紧密连接蛋白参与细胞的分化和增殖，在组织损伤修复及细胞再生方面发挥重要作用[15]。研究表明，claudin-2蛋白在肠黏膜屏障功能维持中起重要作用，并辅助形成电子选择通道辅助钙离子经细胞旁转运[16]。我们发现，UC小鼠孔道形成,蛋白claudin-2表达升高，同时随着上皮细胞凋亡的升高，导致上皮细胞损伤，并可能增强细胞旁途径的渗透能力，加重肠黏膜损伤。

本课题研究结果提示UC小鼠存在黏蛋白表达减少，肠上皮细胞紧密连接间隙增宽，上皮细胞凋亡明显较正常组增多，并伴cingulin调控肠道紧密连接蛋白中孔道蛋白claudin-2表达上升。我们推测cingulin蛋白表达增加，导致孔道形成，claudin-2表达呈上升趋势，由此可能促使肠黏膜通透性增加，大量食物抗原逸入、肠道菌群移位，结肠黏膜免疫失常，导致肠黏膜受损、溃疡。因此，以调控cingulin、claudin-2蛋白为着眼点，促进肠黏膜屏障修复及其功能完整，将有望为UC防治提供新的靶点。

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(责任编辑：马 军)

Effect of the intestinal barrier dysfunction and the changes of cingulin and claudin-2 in ulcerative colitis

CHEN Siyu1, HUANG Huiyun1, CHEN Yu2, PING Qian2, ZHANG Tao1

1. Department of Gastroenterology, the Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of TCM, Nanning 530011; 2. Guangxi University of TCM, China

Objective To investigate the mechanism of ulcerative colitis (UC) via the observation of colon mucosa morphological and ultrastructural and the expressions of cingulin, claudin-2. Methods Forty Balb-c rats were randomly divided into normal group and model group. Except normal group, the model group was administrated by drinking 5% DSS for the preparation of UC model. All rats were sacarificed after eighth weeks. The mucosa tissue morphology, colonic ultrastructure and the epithelial mucosa barrier were detected by the light microscope and electron microscope respectively. The changes of colonic mucin were detected by AB-PAS and HID-AB staining. The expressions of cingulin and claudin-2 in the colonic mucosa were detected by Real-time PCR. Results There were different degrees of defected colonic mucosa, ulceration and crypt abscess with necrotic tissue on surface under light microscope in model group. Also there were microvilli sparse on the intestinal epithelial cell, the intercellular spaces, the decreased goblet cells, the swelling mitochondria, the unclear structure with vacuolar degeneration, the pyknosis nuclear and apoptotic bodies under electron microscope. The expressions of colonic mucin secretion in model group was significantly higher than taht in the normal group (P<0.05). The expressions of cingulin and claudin-2 in model group were 1.03±0.39 and 1.12±0.26 respectively and there was a statistical difference compared with normal group (P<0.05). Conclusion Cingulin plays an important role in the control of claudin-2 expression and response to the onset of UC.

Cingulin; Claudin-2; Tight junction; Intestinal mucosa barrier; Ulcerative colitis

国家自然基金(81260536)；广西自然基金(2013GNSFAA019116)

陈思羽，主治医师，研究方向：消化系疾病基础与临床。E-mail：11589351@qq.com

张涛，副研究员，博士，研究方向：炎症性肠病中西医结合防治。E-mail：327664246@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.010

R574.62

A

1006-5709(2016)01-0043-04

2015-03-26