当归黄芪提取物对慢性腹膜功能衰竭大鼠腹膜功能、结构及TGF-β1表达的影响*

杜丽东，吴国泰，王凤玲，张瑛，任远△

当归黄芪提取物对慢性腹膜功能衰竭大鼠腹膜功能、结构及TGF-β1表达的影响*

杜丽东1，2，吴国泰1，2，王凤玲3，张瑛1，任远1，2△

(1．甘肃中医药大学，2．甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，3．甘肃省第二人民医院，兰州730000)

目的:观察当归黄芪提取物(EAA)对大鼠腹膜功能、结构及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法:50只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、EAA高、低剂量组(n=10)。除正常对照组外，其余4组大鼠每天腹腔注射4．25%高糖腹透液100 ml/kg，连续40 d，并在第8天、10天、12天腹腔注射大肠杆菌脂多糖(LPS)5 mg/kg，建立大鼠慢性腹膜功能衰竭模型，造模的同时灌胃给予相应药物。通过称大鼠体重和观察活动状态，测定超滤量、腹膜转运功能参数、壁层腹膜厚度、壁层腹膜TGF-β1的表达，研究EAA对大鼠腹膜功能、结构的保护作用及TGF-β1表达的影响。结果:EAA能升高高糖腹膜透析液联合LPS诱发的腹膜功能衰竭大鼠超滤量和腹膜转运功能参数;使大鼠腹膜增厚程度降低，TGF-β1表达减少。结论:EAA对大鼠腹膜功能、结构具有一定的保护作用且能抑制TGF-β1表达。

当归黄芪提取物;腹膜透析;腹膜结构;腹膜功能;TGF-β1;大鼠

腹膜透析是终末期肾衰患者替代治疗的重要手段之一，具有较多的比较优势，随着透析时间延长，腹膜纤维化、腹膜超滤和转运功能下降，甚至衰竭成为腹膜透析终止的主要原因［1，2］。因此，积极探寻保护腹膜功能的治疗方法及药物，预防和延缓腹膜功能衰竭是长期腹膜透析患者透析成功的关键。研究显示［3］腹膜间皮细胞损伤、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的过度表达使细胞移行、细胞外基质合成增多在腹膜功能衰竭中扮演重要角色。研究多集中在腹膜透析时腹透液中加入中药制剂或加用中药口服，以保护腹膜间皮细胞、改善患者整体状况，提高患者生存质量。中药当归、黄芪含有多糖、皂苷、黄酮和微量元素，具扩张小血管、改善微循环、抗炎、调节免疫功能、抗氧化等多重药理作用［4，5］。现代医学研究证明两药在肾、肝、肺等多个器官具有抗纤维化作用［6，7］。本研究建立大鼠腹膜功能衰竭模型，观察当归黄芪提取物对大鼠腹膜功能、结构和TGF-β1表达的影响，为其在临床上的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1药物与试剂

当归和黄芪饮片，均购自兰州复兴厚药材有限公司，批号分别为20141108和20150117，经甘肃中医药大学刘峰林博士鉴定为伞形科植物当归Angelicae sinensis(Olive．)Diels和豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．Var．mongholicus (Bge．)Hsiao的干燥根;取当归和黄芪饮片按1∶2质量比混合，加水浸泡30 min后，煎煮2次，用水量分别为药物的10和8倍，每次煎煮1 h，混合两次滤液，浓缩至每毫升1 g药材，冷藏备用。腹膜透析液(4．25%)，批号:G1409021，广州百特医疗用品有限公司生产;盐酸贝那普利片，批号:140803，上海新亚药业闵行有限公司生产;大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，Lot:044M4004 V，Sigma试剂公司;水合氯醛，批号:20150120，天津市致远化学试剂有限公司生产;TGF-β1一抗，批号:Lo414，二抗，批号:15121A04，DBA显色剂，批号:K146712F均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;其余试剂为分析纯。

1．2实验动物

SPF级SD大鼠，50只，体重(160±20)g，雌雄兼用，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK(甘)2011-0004，常规饲养在温度20℃±2℃，相对湿度60%～70%的环境中，适应7 d后开始实验。

1．3仪器

AU5400全自动生化分析仪(日本奥林巴斯产业株式会社)，BX51-32H01显微镜(日本奥林巴斯产业株式会社)，TGL16M常速低温离心机(湖南省凯达科学仪器有限公司)，BS1103型Sartorius电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1．4慢性腹膜功能衰竭模型的复制

［8］，大鼠每天腹腔注射4．25%高糖透析液100 ml/kg，连续40 d，在第8天、10天、12天腹腔注射大肠杆菌脂多糖5 mg/kg，建立大鼠慢性腹膜功能衰竭模型。

1．5实验分组与处理

50只SPF级SD大鼠随机分为5组(n=10):即正常对照组、模型对照组、贝那普利组、EAA高、低剂量组。造模的同时灌胃给药，阳性对照组给予盐酸贝那普利2．1 mg/kg，EAA高、低剂量组分别给予EAA生药12 g/kg、3 g/kg，空白对照组和模型对照组给予等容量生理盐水，给药容量10 ml/kg，每天1次，连续40 d。

1．6观察指标

1．6．1大鼠体重和活动状态各组大鼠分别在造模前和给药第10天、20天、30天、40天称体重，观察活动状态。

1．6．2对大鼠腹膜转运功能参数Dcr/Pcr，DUN/PUN及DGlu/D0Glu的影响造模给药第40天(各组大鼠提前禁食12 h)，腹腔注射4．25%透析液2 h后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉大鼠，心脏采血约3 ml，制备血清，全自动生化分析仪检测血清中肌酐(creatinine，PCr)和尿素氮(urea nitrogen，PUN)的含量;脱颈椎处死大鼠，无菌注射器抽取腹水约5 ml，离心(1 500 r/min×15 min)，取上清液，全自动生化分析仪检测腹透液中肌酐(creatinine，Dcr)、尿素氮(urea nitrogen，DUN)及葡萄糖(glucose，DGlu)的含量。计算腹膜转运功能参数:Dcr/Pcr、DUN/ PUN、DGlu/D0Glu，其中D0Glu为4．25%透析液中的葡萄糖含量。

1．6．3对大鼠超滤量(ultrafiltration volume，UF)和净超滤量(net ultrafiltration volume，Net UF)的影响

准确计量各大鼠腹腔内液体容量，按公式计算UF和Net UF。UF(ml)=腹腔内液体容量〔包括已抽出的透析液5 ml，用注射器可抽出的液体量和纱布提取的液体量〕。Net UF(ml)=UF-0h时(初始)腹腔注射的透析液量(ml)。纱布提取的液体量(ml) =［湿纱布质量(g)-干纱布质量(g)］×1．08(透析液的密度为1．08 g/ml)。

1．6．4对大鼠腹膜厚度的改变取各大鼠右侧壁层腹膜组织约2 cm×1 cm，10%的甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。每张切片100倍光镜下随机选取5个视野，每个视野分5处测量，取平均值作为壁层腹膜厚度。

1．6．5对大鼠壁层腹膜TGF-β1的表达取各大鼠左侧壁层腹膜组织约2 cm×1 cm，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，免疫组化染色。使用Image-Pro Plus 6．0图像分析系统处理，计算平均积分光密度(IOD)。

1．7统计学处理

实验数据采用均数±标准差(珋x±s)的形式表示，两组间差异性比较采用t检验，应用SPSS 17．0统计软件进行统计处理。

2 结果

2．1对大鼠体重和活动状态的影响

与正常对照组比较，各组大鼠体重无明显差异，活动状态均未见异常。

2．2对大鼠腹膜转运功能参数Dcr/Pcr、DUN/PUN及DGlu/D0Glu的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠Dcr/Pcr、DUN/PUN及DGlu/D0Glu均显著降低(P＜0．01);表明造

模使腹膜对肌酐、尿素氮的清除功能下降，葡萄糖的重吸收增多，腹膜转运功能降低。与模型对照组比较，EAA高剂量组Dcr/Pcr，DUN/PUN和DGlu/D0Glu均显著升高(P＜0．05，P＜0．01);EAA低剂量组DUN/PUN和DGlu/D0Glu显著升高(P＜0．05，P＜0．01)，表明EAA可改善腹膜转运功能，使肌酐、尿素氮的清除增多，葡萄糖的重吸收减少(表1)。

2．3对大鼠超滤量(UF)和净超滤量(NetUF)的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠UF显著降低(P＜0．01);与模型对照组比较，EAA高剂量组大鼠UF显著升高(P＜0．05)，EAA低剂量组UF升高，但差异无统计学意义(表2)。

Tab．1 Effects of EAA on the Dcr/Pcr，DUN/PUNand DGlu/D0Gluin rats(珋x±s，n=10)

Tab．2 Effects of EAA on the levels of UF and Net UF in rats (ml，珋x±s，n=10)

2．4对大鼠腹膜厚度的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠腹膜厚度显著增厚(P＜0．01);与模型对照组比较，EAA高、低剂量组大鼠腹膜增厚程度显著降低(P＜0．05，P＜0．01);与阳性对照组比较，EAA高剂量组大鼠腹膜增厚程度显著降低(P＜0．01)，EAA低剂量组腹膜增厚不明显(表3)。

Tab．3 Effects of EAA on the thickness of parietal peritoneum in rats(珋x±s，n=10)

2．5对大鼠壁层腹膜TGF-β1表达的影响

正常对照组大鼠腹膜组织胞浆中TGF-β1仅有微弱表达，与正常对照组比较，模型对照组大鼠腹膜间皮细胞、浸润的炎症细胞及血管内皮细胞中TGF-β1表达显著增加(P＜0．01);与模型对照组比较，EAA高、低剂量组TGF-β1表达显著降低(P＜0．05);与阳性对照组比较，EAA高剂量组TGF-β1表达降低，但差异无统计学意义(P＞0．05，表4)。

Tab．4 Effects of EAA on the expression of TGF-β1in parietal peritoneum in rats(珋x±s，n=10)

3 讨论

腹膜透析是利用腹膜作为半透膜，借助血浆与透析液中溶质浓度梯度和渗透梯度，通过弥散、渗透、超滤等原理清除体内代谢产物，超滤水分，维持电解质和酸碱平衡，同时由透析液补充体内必须物质。目前腹膜透析成为治疗慢性肾功能不全的安全、有效的方法而被广泛使用。但在长期的腹膜透析过程中，由于大量的非生理性腹透液注入腹腔内，腹膜长期浸泡在低pH、高糖、高乳酸盐和葡萄糖降解产物的腹透液中，改变了腹腔原来的生理状态，使腹腔的防御功能降低，腹膜间皮细胞损伤，最终导致腹膜增生、硬化、腹膜功能衰竭，腹膜透析失败［9］。组织病理学研究表明腹膜功能衰竭的表现为［3］:腹膜间皮细胞损伤和腹膜间皮-上皮细胞转分化(EMT)。因此防治腹膜纤维化而致腹膜功能衰竭的重要靶点是防治腹膜间皮细胞损伤、防治EMT导致细胞移行和细胞外基质合成增多。TGF-β是EMT过程中的关键细胞因子，能刺激腹膜间皮细胞分泌细胞外基质，促进腹膜功能衰竭。相反，抑制TGF-β的过度表达，就能抑制其下游相应的细胞因子，减缓EMT的发生和发展，保护腹膜的结构和功能。研究表明长期应用高浓度葡萄糖透析液，葡萄糖在人体内最终转化为终末期糖基化产物，可引起腹膜慢性损伤及机械剥脱，导致纤维化并最终造成超滤衰竭。研究报道［10］透析液中添加LPS可使腹膜超滤功能和转运功能下降，腹膜结构发生病理变化。本研究采用腹腔注射4．25%的高糖透析液联合大肠杆菌脂多糖建立腹膜功能衰竭模型，结果显示，模型对照组大鼠腹膜对水的超滤和溶质转运减少，葡萄糖的重吸收增多;腹膜发生增厚等病理变化，TGF-β1表达增多。与文献报道的腹膜纤维化而致腹膜功能衰竭的效果一致，该方法操作简单、成本较低，比较适合药物筛选和基础研究。

盐酸贝那普利是一种血管紧张素转化酶抑制剂，研究表明［11］该药能减少血管紧张素Ⅱ的生成，减缓血管紧张素在腹膜增厚等病理变化中的作用。因此，在现有的腹膜透析研究中多用盐酸贝那普利作为阳性对照药物。

在目前对于腹膜透析致腹膜功能衰竭尚无行之有效的办法的情况下;我国许多研究人员把目光集中在向透液中加入腹膜保护剂和活血化淤的中药，或者口服中药制剂，延缓腹膜功能衰竭，提高患者生活质量。中药当归、黄芪分别为补血活血、补气药，当归黄芪药对是常见的气血双补、益气活血药对，当归与黄芪常用配伍比例［12］为1∶2，2∶3，2∶1，3∶2，1∶5，当归与黄芪1∶1应用，体现益气补血;1∶2应用，体现益气以养血;2∶1应用，体现养血补气，补虚安胎;1∶5应用，体现有形之血生于无形之气，大补脾肺之气以资化源，气旺以生血。本研究发现EAA高剂量组Dcr/Pcr，DUN/PUN和DGlu/D0Glu显著升高;EAA低剂量组DUN/PUN和DGlu/D0Glu显著升高，说明不同剂量的EAA可不同程度的提高腹膜对水分的超滤，增加小分子溶质的清除，降低葡萄糖的重吸收，改善腹膜转运功能。EAA能不同程度降低腹膜组织增厚程度且降低TGF-β1表达。

综上所述，当归黄芪提取物具有改善腹膜结构和功能，抑制壁层腹膜TGF-β1过度表达，通过抑制壁层腹膜TGF-β1表达而对抗慢性腹膜功能衰竭的作用。

【参考文献】

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Effects of extraction of Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus on the peritoneal structure，functions and TGF-β1expression in the chronic peritoneal failure rats

DU Li-dong1，2，WU Guo-tai1，2，WANG Feng-ling3，ZHANG Ying1，REN Yuan1，2△
(1．Gansu University of Chinese Medicine，2．Gansu Province Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine，3．The Second People’s Hospital of Gansu Province，Lanzhou 730000，China)

Objective:To study the effects of extraction of Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus(EAA)on the peritoneal structure，functions and transforming growth factor-β1(TGF-β1)expression in the chronic peritoneal failure rats．Methods:Fifty SD rats were randomly divided into normal control group，model control group，positive control group，high-dose and low-dose EAA group(n=10)．The modeling rats were established by intraperitoneal injection(ip)4．25%high-glucose peritoneal dialysate 100 ml/ kg，lasted 40 d，and ip lipopolysaccharides(LPS)5 mg/kg at8thd，10thd and 12thd．At the same time，the rats were treated with the corresponding drugs．The body weight and general states，the levels of ultrafiltration volume，the parameters of peritoneal transport function，the changes of peritoneal morphology and the TGF-β1expression in parietal peritoneum of rats were observed．Results:EAA could increase the levels of ultrafiltration volume and improve the parameters of peritoneal transport function．The peritoneal thickness were decreased，and the TGF-β1expression in parietal peritoneum were also lowered significantly．Conclusion:EAA has some protective effects on the peritoneal structure and functions，and can inhibit TGF-β1expression．

Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus;peritoneal dialysis;peritonealstructure;peritoneal function; TGF-β1;rats

R285．5

A

1000-6834(2016)06-563-04

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．017

甘肃省自然科学基金项目(1310RJZA090);甘肃中医学院中青年基金项目(BH2012-023)

2015-08-25

2016-05-28

△【通讯作者】Tel:0931-8762653;E-mail:Leyuan816@163．com

EAA:Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus;UF: Ultrafiltration volume

*P＜0．05，＊＊P＜0．01 vs control group;#P＜0．05 vs model group