尿毒症晚期糖基化终产物和蛋白结合溶质通过抑制Krüppel-样因子2诱导腹膜间皮细胞功能障碍的机制研究

福建省南安市医院（362300）黄德胜 庄宇亮

常规血液透析无法将蛋白质结合尿毒症毒素排出体外，导致患者受到蛋白质结合尿毒症毒素的危害[1][2][3]。当氯化氧化剂的损伤后，所产生的含有双酪氨酸的蛋白交联产物即为AOPP[4]。AOPP可刺激单核细胞分泌TNF-α等炎症因子[5]。腹膜表层间皮细胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）可维持腹膜结构和功能稳定[6][7]。AGEs可导致腹膜功能衰竭[8]。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）及转化生长因子β1（TGF-β1）等与腹膜间皮细胞发生EMT相关。本研究探讨尿毒症晚期糖基化终产物和蛋白结合溶质诱导腹膜间皮细胞功能障碍的机制。

1 方法

1.1 细胞培养 将人腹膜间皮细胞（HPMC）移至25mL的细胞培养瓶中，补充含10%胎牛血清的M119培养基至5mL。将细胞置于37℃下的CO2培养箱中进行培养和传代。

1.2 MTT法测定各组细胞增殖抑制率 选取含有0、20、40、60、80、100和120mM的AGEs和AOPP分别作用于人腹膜间皮细胞，采用MTT法测定不同浓度的AGEs或AOPP对各组细胞的增殖抑制率。用酶标仪在570nm处测定吸光度值。细胞增殖抑制率（%）=（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.3 实时定量PCR（q-PCR）法 人腹膜间皮细胞分组为正常对照（Control）组、80mM AGEs处理（AGEs）组和60mM AOPP处理（AOPP）组。反转录体系为20μL：1μL总RNA，4μL 5×Reaction Mix，2μL10×Super Script Enzyme Mix，加入双蒸水将体系补足至20μL，混匀后离心。反应条件为：37℃下60min，95℃下5min，置于4℃保存备用。基因的相对表达用2-△△CT法进行计算。

1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法 电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。一抗（1∶1000）4℃孵育过夜。用TBST洗膜三次，每次15min，二抗（1∶4000）室温孵育2h，用TBST洗膜三次。化学发光法显色。

附表1 MTT法测定不同浓度AGEs对人腹膜间皮细胞增殖抑制率（±s）

附表1 MTT法测定不同浓度AGEs对人腹膜间皮细胞增殖抑制率（±s）

注：与正常对照（0mMAGEs）组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AGEs浓度（mM） 细胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 6.75±0.42 40 8.58±0.64*60 11.18±0.53*80 19.33±0.62**100 14.55±0.68*120 10.52±0.35*

附表2 MTT法测定不同浓度AOPP对人腹膜间皮细胞增殖抑制率（±s）

注：与正常对照（0mMAOPP）组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AOPP浓度（mM） 细胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 4.32±0.32 40 6.52±0.25*60 18.25±0.67**80 12.36±0.73*100 9.53±0.65*120 7.54±0.56*

附表3 q-PCR法检测各组细胞中KLF2的mRNA表达（±s）

注：与Control组相比，**P＜0.01。

组别 KLF2相对mRNA表达Control组 1.00 AGEs组 0.56±0.09**AOPP组 0.47±0.07**

附表4 q-PCR法检测各组细胞中TGF-β1的mRNA表达（±s）

附表4 q-PCR法检测各组细胞中TGF-β1的mRNA表达（±s）

注：与Control组相比，**P＜0.01。

组别 TGF-β1相对mRNA表达Control组 1.00 AGEs组 0.56±0.09**AOPP组 0.47±0.07**

2 结果

2.1 MTT法测定不同浓度AGEs对人腹膜间皮细胞增殖抑制率 见附表1。

2.2 MTT法测定不同浓度AOPP对人腹膜间皮细胞增殖抑制率 见附表2。

2.3 q-PCR法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中KLF2 mRNA表达的影响 见附表3。

2.4 q-PCR法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中TGF-β1 mRNA表达的影响 见附表4。

2.5 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中Collagen I 蛋白表达的影响 如附图1所示，与正常对照组相比，AGEs组和AOPP组人腹膜间皮细胞中Collagen I的蛋白表达上调（P＜0.01）。

2.6 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中α-SMA蛋白表达的影响 如附图2所示，与正常对照组相比，AGEs组和AOPP组人腹膜间皮细胞中α-SMA的蛋白表达上调，有统计学意义（P＜0.01）。

2.7 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中E-cadherin蛋白表达的影响 如附图3所示，与正常对照组相比，AGEs组和AOPP组人腹膜间皮细胞中E-cadherin的蛋白表达下调，有统计学意义（P＜0.01）。

附图1 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中Collagen I蛋白表达的影响

附图2 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中α-SMA蛋白表达的影响

附图3 Western Blot法测定AGEs和AOPP对人腹膜间皮细胞中E-cadherin蛋白表达的影响

3 讨论

腹膜间皮细胞可抵抗非生理性的腹膜透析液对基底膜及膜下结缔组织的损伤。腹膜间皮细胞对维持腹腔的抗菌防御、细胞外基质的合成和降解、调节局部血管张力及腹腔内环境的稳定有重要的作用。尿毒症晚期糖基化终产物（AGEs）和蛋白结合溶质（AOPP）是尿毒症患者透析过程中产生的非生理性的物质，可损伤腹膜间皮细胞的结构和功能，导致腹膜功能衰竭。

KLF2因子可表达于成熟的内皮细胞中，可通过抑制炎症相关信号通路，从而发挥其抗炎功能。高浓度的糖含量抑制KLF2表达，从而加重内皮细胞的损伤及炎症反应。本研究发现，AGE和AOPP均可抑制人腹膜间皮细胞中KLF2的mRNA表达。

本研究发现，AGE和AOPP均可提高人腹膜间皮细胞中TGF-β1的mRNA表达，促进腹膜透析时腹膜纤维化和腹膜新生血管的形成。当腹膜间皮细胞发生EMT后，细胞间粘附连接蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Collagen I)的表达发生变化。α-SMA是细胞转化为肌成纤维细胞的标志性蛋白。此外，本研究还发现，人腹膜间皮细胞在受到AGEs或AOPP刺激后，AGE和AOPP均可促进人腹膜间皮细胞的EMT过程，诱导人腹膜间皮细胞功能障碍。

综上所述，尿毒症晚期糖基化终产物可通过抑制Krüppel-样因子2上调TGF-β1、Collagen I和α-SMA的表达，下调E-cadherin的表达，诱导人腹膜间皮细胞的上皮-间叶转化，进而导致人腹膜间皮细胞功能障碍。