阿霉素损伤心肌细胞miRNA378与网腔钙结合蛋白、内质网应激的关系*

阿霉素损伤心肌细胞miRNA378与网腔钙结合蛋白、内质网应激的关系*

阿霉素(doxorubicin)属于蒽醌类抗生素，是目前最为有效的抗肿瘤药物之一，其主要的毒副反应是累积性、剂量依赖性的心肌毒性反应，可进一步发展成不可逆性心肌损伤，最终导致充血性心力衰竭［1］。关于阿霉素心肌病的发病机制目前尚未清楚，近年来认为与心肌细胞凋亡密切相关［2-4］。凋亡的产生机制复杂，近年发现内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)介导的细胞凋亡是一条新的细胞凋亡信号转导通路［5］。网腔钙结合蛋白(calumenin)是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白［6］，文献报道:calumenin缓解心肌细胞ERS并减少ERS介导的心肌细胞凋亡数量［7］。microRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶蛋白mR-NA 3＇端非编码区的不完全互补结合，抑制靶mRNA转录后的表达。文献报道［8］:miRNA-378和miRNA-378下调H9c2心肌细胞calumenin表达。本实验拟从阿霉素损伤心肌细胞miRNA378与calumenin、内质网应激相互关系和调控机制进行研究，一定程度上揭示阿霉素心肌病合并心力衰竭的发生机制，为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1．1动物与试剂

1～3 d，Balb/c新生乳鼠购置吉林大学基础医学院动物中心，许可证号:scxk(吉)2011-0004;Ⅱ型胶原酶购于SCIENTIFIC，胰蛋白酶购于碧云天，Super M-MLV反转录酶(BioTeke)公司，RNA simple Total RNA Kit试剂盒(TIANGEN)公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，慢病毒转染质粒由沈阳万类生物科技公司合成;阿霉素(深圳万东药业)。

1．2乳鼠心肌细胞的分离与培养

将乳鼠心脏放入培养皿中，PBS反复清洗。将心脏组织剪碎至1～3 mm3小块。加入0．1%Ⅱ型胶原酶以及0．1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化好后将其移入15 ml离心管1 500 r/min离心7 min去上清。用PBS重悬沉淀，用吸管反复吹打后1 000 r/min离心5 min，用培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织。PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培养基重悬细胞，细胞计数后放置到培养板中。成纤维细胞贴壁较快，2 h差速贴壁法可去除大量的成纤维细胞，上清悬液中为较纯的心肌细胞。细胞放置在培养板后静止培养24 h，以后2 d换1次液。培养细胞至密度为90%左右，PBS清洗2次。按实验内容将细胞接种于6孔板中，细胞浓度为5 ×104cells/ml，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养过夜。24 h后可进行转染，细胞密度一般在70%为宜。

1．3免疫组织化学方法鉴定培养的乳鼠心肌细胞

各组乳鼠培养心肌细胞进行免疫组化鉴定: (1)0．1%TritonX-100孵育;(2)3%过氧化氢孵育; (3)血清封闭;(4)一抗孵育;(5)二抗孵育;(6)辣根酶标记;(7)DAB显色;(8)苏木素复染;(9)镜检。

1．4慢病毒转染构建miRNA-378高表达组

(1)准备病毒:取出4℃保存的慢病毒(Invitrogen公司)，使用前轻轻摇匀。(2)感染目的细胞:病毒准备好之后，从培养箱中取出细胞，细胞状态较好则开始实验。(3)使用移液器吸取一定量(病毒数与细胞数比值为100∶1)的病毒液加入准备好的培养基中。(4)在培养基中加入ploybrene(6μg/ml)来提高病毒的感染效率。(5)吸去细胞中原有的培养基，在转染慢病毒细胞和对照细胞中分别加入含有病毒液的新培养基。(6)混匀后放于37℃，5% CO2的培养箱内孵育过夜。(7)24 h后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液(含有10%血清的DMEM培养基)，37℃、5%CO2继续培养。

1．5miRNA378沉默细胞的构建及实验分组

乳鼠心肌细胞接种于6孔板中，生长至细胞密度60%～75%时，参照Lipofectamine TM 2000说明书进行转染。实验组转染miR-378干扰序列(吉玛生物)，阴性对照组转染阴性序列，空白对照组转染生理盐水。转染的细胞继续培养，72 h稳定表达后进行后续实验。将上述两种处理后细胞更换完全培养基，进行实验分组:正常对照组、模型组(3 mg/l阿霉素)，miRNA-378过表达对照组(阿霉素3 mg/L +miRNA-378过表达空质粒)，miRNA-378过表达对照组(阿霉素3 mg/L+miRNA-378过表达质粒)，miRNA-378沉默对照组(阿霉素3 mg/L+miRNA-378沉默空质粒)，miRNA-378沉默组(阿霉素3 mg/L+miRNA-378沉默质粒)，每组设计6个复孔。

1．6RealtimePCR检测各组心肌细胞calumenin、GRP78mRNA表达

经real time PCR实验步骤对各组心肌细胞calumenin、GRP78 mRNA表达进行检测。每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，实验重复3次(n= 3)，实验数据的选取，是舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据，利用2-△△CT方法分析数据。

1．7统计学处理

实验结果以均数±标准差(珋x±s)表示，采用SSPS 11．5统计分析软件进行数据分析，不同组间采用配对t检验。

2 结果

2．1乳鼠心肌细胞免疫组化鉴定

乳鼠培养心肌细胞经免疫组化实验，检测出心肌细胞特有的ɑ-SMA蛋白，确定为心室肌细胞(图1)。

Fig．1 Cultured myocardial cell(A)the immunocytochemistry of cultured myocardial cell(B)(×400)

2．2检测各组心肌细胞miRNA378表达

为验证慢病毒转染质粒是否成功上调或沉默miRNA378，real time PCR检测对照组、miRNA378过表达对照组、miRNA378过表达组、miRNA378沉默对照组、miRNA378沉默组心肌细胞miRNA378表达，实验结果显示miRNA378过表达组心肌细胞miRNA378过表达成功(表1)。

2．3各组心肌细胞calumeninmRNA表达检测

与对照组相比较，阿霉素组心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少(P＜0．01);与阿霉素组相比较，miRNA378过表达组心肌细胞calumenin mRNA表达增加(P＜0．01);与阿霉素组相比较，miRNA378沉默组calumenin mRNA表达无统计学意义(表1)。

2．4各组心肌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78 mRNA表达检测

与对照组相比较，阿霉素组心肌细胞GRP78 mRNA表达明显增加(P＜0．01);与阿霉素组相比较，miRNA378过表达组心肌细胞GRP78 mRNA表达减少(P＜0．01);与阿霉素组相比较，miRNA378沉默组GRP78 mRNA表达无统计学意义(表1)。

Tab．1 The expressions of miRNA378/，calumenin/and GRP78 expression assayed by real-time quantitative PCR in different groups(珋x±s，n=6)

3 讨论

内质网是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的细胞器。内质网稳态失衡时，内质网正确折叠蛋白质功能异常，可能致误折叠蛋白在内质网内异常聚集及内质网应激性蛋白分泌增加，并且识别错误折叠蛋白，并通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即ERS．本团队在前期研究中发现:内质网应激介到了阿霉素心肌病大鼠心肌细胞凋亡［9］，calumenin对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用［10］，而且发现阿霉素损伤可能诱发ERS，并通过ERS凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF4→CHOP/ IRE1→CHOP引起心肌细胞凋亡［11］。研究发现miRNA-378通过影响转化因子β1(TGFβ-1)分泌而参与心肌纤维化过程［12］，抑制miRNA-378表达能诱导小鼠心肌纤维化［13］，重度心力衰竭患者miRNA-378和miRNA-378表达显著下降，随着患者心功能好转，miRNA-378和miRNA-378表达也明显增加［14］，并且miRNA-378下调H9 c2心肌细胞calumenin表达［8］。但阿霉素损伤心肌细胞ERS、calumenin与miRNA是否存在相互关系?如果相互关联，其调控机制又是如何?为明确这一问题，我们提出如下科学假说:阿霉素通过干预心肌细胞miRNA-378表达来影响calumenin表达，进而引起ERS并通过ERS凋亡信号通路介导心肌细胞凋亡。但要明确miRNA-378调控calumenin表达进而引发ERS的机制，必须上调miRNA-378表达，观察calumenin及GRP78表达情况，再沉默miRNA-378观察calumenin及GRP78表达情况。本实验观察到上调阿霉素损伤心肌细胞miRNA-378表达后并没有出现预想的calumenin表达减少，反而出现calumenin表达增加。但根据已发表文献报道miRNA-378下调calumenin表达［8］，因此上调miRNA378表达引起calumenin表达增加可能是间接调节作用而非直接调节作用。但上调阿霉素损伤心肌细胞miRNA378表达是如何间接调节calumenin表达的，则还需要在以后实验中进一步阐明。

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The relationship between miRNA378，calumenin and endoplasmic reticulum stress in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by adriamycin

ZHAO Ming1△，CUI Xiao-xue2，YU Miao2，WANG Yi-lin2，LONG Jie2，ZHAO Qiang1
(1．The First Clinical Medical College of Inner Mongolia University for Nationalities，2．Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China)

Objective:To investigate the relationship between miRNA378，calumenin and endoplasmic reticulum stress in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by adriamycin．Methods:The suckling mouse myocardium of primary culture were randomly divided into control group，adriamycin group，lentivirus infection miRNA378 over expression control group，lentivirus infection miRNA378 over expression group，lentivirus infection miRNA378 silence control group and lentivirus infection miRNA378 silence group．Firstly to identify the suckling mouse myocardium，α-SMA was monitored by immunohistochemical method，and secondly the ventricular myocytes were transfered by lentivirus plasmids．Then the expression change of miRNA378，calumenin and glucose regulated protein 78(GRP78)mRNA were detected by Quantitative Real-time PCR．Results:Compared with the adriamycin infection group，the expression of calumenin mRNA in lentivirus infection miRNA378 over expression group was increased(P＜0．01)，while the expression of GRP78 mRNA was reduced(P＜0．01);Compared with the adriamycin infection group，the expressions of calumenin and GRP78 mRNA in lentivirus infection miRNA378 silence group did not change insignificantly．Conclusion:Adriamycin injection may cause expression of calumenin in suckling mouse myocardium with myocarditis reduced，which may lead to the endoplasmic reticulum stress．This effect is related with miRNA378．

adriamycin;endoplasmic reticulum stress;miRNA378;calumenin;suckling mouse

2015-11-16

2016-06-28

△【通讯作者】Tel:13474859991;E-mail:langzhe73@163．com