Klotho基因G-395A多态性与华中地区老年汉族人群颈动脉内中膜厚度的相关性

刘　玮　张韶英　徐慧敏　管斯斯

(武汉市中心医院老年科，湖北　武汉　430014)



Klotho基因G-395A多态性与华中地区老年汉族人群颈动脉内中膜厚度的相关性

刘玮张韶英徐慧敏管斯斯

(武汉市中心医院老年科，湖北武汉430014)

〔摘要〕目的探讨Klotho基因G-395A位点多态性与华中地区老年(年龄≥60岁)汉族人群颈动脉内中膜厚度(IMT)的相关性。方法随机选取278例华中地区老年汉族患者，根据IMT分为IMT增厚组(IMT≥1 mm，132例)和对照组(IMT<1 mm，146例)，分别检测各组血压、血糖、血脂等生化指标，并用TaqMan基因探针法检测各组Klotho基因G-395A位点的基因型。结果与对照组相比，IMT增厚组GG基因型和G等位基因频率明显增高，AA基因型和A等位基因频率明显降低，AG基因型无明显差异。经多元Logistic回归分析后，G等位基因频率与IMT增厚存在相关性，为IMT增厚的独立危险因子。结论Klotho基因G-395A位点多态性与华中地区老年汉族人群颈动脉IMT具有相关性，G-395A多态性有可能作为颈动脉IMT增厚的预测指标之一。

〔关键词〕Klotho基因；单核苷酸多态性；颈动脉内中膜厚度；动脉粥样硬化

Klotho基因是Kuro-o等〔1〕于1997年发现的与衰老有关的新基因。Klotho基因被敲除的小鼠可出现类似人类衰老的各种表型，如寿命缩短、不育症、动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等〔2〕。目前的研究表明，Klotho基因与动脉粥样硬化相关。Klotho基因缺陷的小鼠在出生4 w后即可出现动脉粥样硬化，并随着增龄而加重，表现为主动脉严重钙化、肌性动脉中层钙化、内膜增厚，这些变化与人类动脉粥样硬化非常相似〔1〕。把外源性正常Klotho cDNA转导给Klotho基因缺陷的小鼠后，其动脉粥样硬化程度可得到显著改善〔2〕。颈动脉内中膜厚度(IMT)增厚是动脉粥样硬化病理过程中的早期标志，是反映大动脉粥样硬化的早期的、无创性指标〔3，4〕。目前国内外有关Klotho基因多态性与颈动脉IMT增厚相关性的研究极少。本研究拟通过对Klotho基因G-395A多态性位点进行基因型分析，探讨Klotho基因的G-395A位点多态性与老年人群颈动脉IMT增厚的关系。

1对象与方法

1.1研究对象样本来自2012年3～11月武汉市中心医院老年科，随机选取年龄≥60岁的老年住院病人278例，男136例，女142例，年龄60～97岁。研究纳入标准：年龄≥60岁，无亲属相关关系的、愿意接受项目研究者即可。所有参加研究对象均告知并签署知情同意书。记录入选病例的年龄，吸烟史，测量身高、体重、计算体重指数(BMI)，测量收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，清晨空腹采血化验血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.2颈动脉超声检查患者取卧位，颈部侧伸45°，测定颈动脉IMT(以颈动脉球形膨胀近端1 cm范围内作为颈总动脉测量区域，以颈总动脉后壁作为测量部位)，测定最厚处及距此远心1 cm 和近心1 cm 点，左右两侧共6点的平均值作为结果。按照颈动脉IMT进行分组。IMT<1.0 mm 者入对照组(146例)；IMT≥1.0 mm者入IMT 增厚组(132例，包括发现颈动脉斑块者89例)。其中每组又根据年龄分为老年组(年龄<80岁)和高龄组(年龄≥80岁)两个亚组。

1.3方法

1.3.1DNA提取留取全部对象早晨空腹全血标本，抽取肘正中静脉血5 ml，EDTA抗凝，用中国大连宝生物工程技术有限公司(TaKaRa)DNA抽提试剂盒提取DNA。

1.3.2Klotho基因G-395A SNP 检测通过美国国家生物信息中心的GenBank获取基因序列及其相应位点的SNP 信息。其中G-395A对应的SNP为rs1207568。由美国ABI公司合成TaqMan 引物和探针，用2×TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，货号：4351379，批号：P130715-008E09)试剂盒进行试验，荧光定量PCR仪(ABI Stepone plus型)上进行扩增。上游引物：5′-TAGGGCCCGGCAGGAT-3＇；下游引物：5′-CCTGGAGCGGCTTCGTC-3＇。探针1：(VIC)-AGTCGGGAAAAGT-(MGB)；探针2：(FAM)-CAAGTCGGGGAAAG-(MGB) 。反应体系为：采用20 μl 反应体系，其中2×TaqMan Master Mix 10 μl，40×引物和TaqMan探针混合物0.5 μl，模板 DNA 2.0 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR 反应条件如下：95℃预变性10 min，随即进入PCR 循环，95℃变性15 s，60℃退火和延伸各1 min，共40个循环。

1.4统计学方法采用SPSS18.0软件行t检验，研究对象基因型与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，应用多元Logistic回归分析基因型与IMT增厚的相关性。

2结果

2.1IMT增厚组与对照组临床资料分析两研究组年龄、DBP、TC、TG、BMI无显著差异(P>0.05)；IMT增厚组血糖、SBP、LDL-C水平、男性及吸烟比例明显高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显低于对照组(P均<0.05)(表1)。

表1　两组临床资料比较±s)

2.2Klotho G-395A SNP分析Klotho基因型分布经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。与对照组相比，IMT增厚组GG基因型及G等位基因频率均明显升高(P<0.05)，IMT增厚组AA基因型及A等位基因频率均明显降低(P<0.05)，两组AG基因型频率无统计学差异(P<0.05)(表2)。亚组分析，与对照组相比，老年组以及高龄组患者的AA基因型及A等位基因频率均明显降低(P<0.05)，G等位基因频率明显增加(P<0.05)，AG基因型频率无统计学意义(P>0.05)。高龄组较对照组GG基因型明显增加(P<0.05)，而老年组与对照组的GG基因型无统计学差异(P>0.05)(表3)。

2.3Klotho基因G-395A位点G等位基因频率与老年患者IMT增厚的关系在调整年龄、性别、吸烟、血压、血脂和血糖等因素并经多元Logistic回归分析后，G等位基因频率与IMT增厚存在相关性，G等位基因为IMT增厚的独立危险因子，而A等位基因频率与IMT增厚存在负相关性，A等位基因对颈动脉IMT增厚具有保护作用(表4)。

表2　Klotho基因 G-395A 多态性分布〔n(%)〕

表3　不同年龄亚组Klotho基因G-395A多态性分布〔n(%)〕

表4　多元Logistic回归分析

3讨论

研究表明人类Klotho基因多个单核苷酸多态性位点与动脉粥样硬化性疾病相关，如Kl-VS等位基因、G-395A多态性、C-1818T多态性等〔5～8〕。新近研究发现Klotho基因启动区G-395A位点基因突变有可能就是该基因表达的一种潜在的调节靶点〔9〕。国外学者Imamura等〔10〕研究日本人群Klotho基因G-395A位点多态性与冠心病的关系时，发现A等位基因携带者其冠心病患病率较高。而同期Rhee等〔6〕在研究韩国60岁以上人群时，发现A等位基因对冠心病具有保护作用。在国内研究中，王虎林等〔11〕研究报道了在重庆地区的汉族人群中，Klotho基因G-395A位点A等位基因携带频率与动脉硬化呈负相关。这说明Klotho基因启动区G-395A位点多态性与冠心病的关系可能存在着地域和年龄效应。

血管壁IMT增厚是动脉粥样硬化的早期征象，颈动脉和近心段的冠状动脉由于所处的解剖部位比较特殊，血流的剪切力比较小，易于形成易损斑块，造成动脉内膜损伤，管腔狭窄。颈动脉由于其位置表浅，用超声检测IMT的厚度可作为反映全身动脉硬化的一个窗口。IMT与动脉粥样硬化危险因素数量间存在相关性，IMT的进展程度与速度更能反映或预测冠心病〔12，13〕。本研究结果说明了G-395A位点多态性与颈动脉IMT增厚的关系可能存在着年龄效应，G等位基因频率与颈动脉IMT增厚存在相关性，为IMT增厚的独立危险因子，而A等位基因对颈动脉IMT增厚具有保护作用。这与Rhee等〔6〕和王虎林等〔11〕的研究结果相符。目前对Klotho基因G-395A位点与冠心病的相关性研究有不同的研究结果。分析其原因首先可能与被研究人群的年龄、地区和种族差异以及冠心病的类型不同有关。其次，可能与样本量与其他基因的交互作用有关。

综上所述，本研究结果显示Klotho基因启动子G-395A位点可能是中国华中地区汉族人群IMT增厚的易感性位点和预测指标。

4参考文献

1Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature，1997；390(6655)：45-51.

2Masuda H，Chikuda H，Suga T，etal.Regulation of multiple ageing-like phenotypes by inducible klotho gene expression in klotho mutant mice〔J〕.Mech Ageing Dev，2005；126(12)：1274-83.

3Bonithon KC，Jouven X，Taquet A，etal.Early carotid atherosclerosis in healthy middle-aged women：a follow up study〔J〕.Stroke，1993；24(12)：1837-43.

4Geroulakos G，Gorman D，Alodiki E，etal.The carotid intima-media thickness as a marker of the presence of severe symptomatic coronary heart disease〔J〕.Eur Heart J，1994；15(6)：781-5.

5Arking DE，Becker DM，Yanek LR，etal.Klotho allele status and the risk of early-onset occult coronary artery disease〔J〕.Am J Hum Genet，2003；72(5)：1154-61.

6Rhee EJ，Oh KW，Lee WY，etal.The differential effects of age on the association of Klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism，2006；55(10)：1344-51.

7Shimokata H，Ando F，Fukukawa Y，etal.Klotho gene promoter polymorphism and cognitive impairment〔J〕.Geriat Gerontol Int，2006；6(2)：136-41.

8Kim Y，Kim JH，Nam YJ，etal.Klotho is a genetic risk factor for ischemic stroke caused by cardioembolism in Korean females〔J〕.Neurosci Lett，2006；407(3)：189-94.

9Wang HL，Xu Q，Wang Z，etal.A potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population〔J〕.Clin Chim Acta，2010；411(5-6)：386-90.

10Imamura A，Okumura K，Ogawa Y，etal.Klotho gene polymorphism may be a genetic risk factor for atherosclerotic coronary artery disease but not for vasospastic angina in Japanese〔J〕.Clin Chim Acta，2006；371(1-2)：65-70.

11王虎林，司良毅，孙兰英，等.Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2008；10(2)：96-8.

12Takashi W，Tsutomu F，Kentaro F.Ultrasonic correlates of common carotid atherosclerosis in patients with coronary artery disease〔J〕.Angiology，2002;53(2)：177-83.

13Simon A，Gariepy J，Chironi G，etal.Intima-media thickness：a new tool for diagnosis and treatment of cardiovascular risk〔J〕.J Hypertens，2002；20(2)：159-69.

〔2014-12-11修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：武汉市科技局资助课题(No.201260523187-4)；武汉市卫生局资助课题(No.YB14B05)；院内基金(No.YB14B05)

通讯作者：张韶英(1963-)，女，学士，主任医师，主要从事衰老及动脉粥样硬化机制研究。

〔中图分类号〕R543.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2132-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.037

第一作者：刘玮(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事衰老及动脉粥样硬化机制研究。