AKT基因介导的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立*

喻兆阳，　何　阳，　罗　伟，　李　蕾

华中科技大学同济医学院药学院，武汉　430030



AKT基因介导的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立*

喻兆阳，何阳，罗伟，李蕾△

华中科技大学同济医学院药学院，武汉430030

摘要：目的通过尾静脉高压注射含有AKT/SB基因质粒的方法，构建一种新型的小鼠非酒精性脂肪肝模型。方法将40只雌性FVB/N小鼠随机分为正常组(n=15)，模型组(n=15)，对照组(n=5)，治疗组(n=5)。正常组与模型组分别给予尾静脉高压注射生理盐水和AKT/SB质粒，于第1、2、3周分批处死，每批处理5只。对照组与治疗组给予尾静脉高压注射AKT/SB质粒，第3周治疗组开始予以白藜芦醇灌胃(0.04 g/kg)，对照组予以等量0.5%CMC-Na溶液灌胃，第5周处死全部对照组和治疗组小鼠。检测小鼠体重，肝湿重，肝指数，血清ALT、AST、TG、TC水平及肝组织中脂肪合成相关蛋白的表达水平，肝脏组织切片进行病理学观察，用以评价不同组别小鼠的病理生理变化。结果模型组小鼠2周后就出现肝功能损伤，脂质代谢紊乱，肝脏脂肪变性明显增加，并出现纤维化和明显的炎性浸润，且造模时间越长，病变程度越严重。治疗组小鼠和对照组小鼠相比，血清中ALT、AST、TC水平均有不同程度的下降，肝组织中脂肪合成相关蛋白的表达水平有所下降，且肝脏切片染色观察脂肪形成明显减少。结论通过尾静脉高压注射方法在肝脏表达AKT基因，FVB/N小鼠在3周内可形成病变程度逐步加重的非酒精性脂肪肝模型。

关键词：非酒精性脂肪肝；尾静脉高压注射法；FVB/N小鼠；AKT基因

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史(酒精摄入量<20 g/d)或其他已知的肝脏病史，以肝细胞脂肪变性和脂质累积为特征的病理综合征[1]，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纤维化和脂肪性肝硬化4个病理过程[2]。随着人们饮食结构和生活方式的改变，以脂肪为代表的高热量食物在日常膳食中所占比例明显增加，这使NAFLD的发病率大幅提高，并已成为医学科研的热点，而动物模型则可以用于非酒精性脂肪肝病的研究[3-4]。目前关于NAFLD动物模型的建立常用的诱导方法有高脂饲料、四氯化碳(CCl4)、四环素以及乙硫氨酸等，这些方法均具有造模周期长、易形成肝纤维化、实验成本高等缺点。研究表明，采用物理或机械的方法将质粒DNA直接导入靶器官可以使目的基因在原位高效表达[5]，且周期短、成本低。而FVB/N小鼠本身作为一个转基因品系，具有很多优势，已被大量应用于基因工程实验中[6]。因此，本实验拟采用尾静脉高压注射法递送脂肪合成相关的AKT/SB基因质粒，使之在肝细胞高效表达，以诱导建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，并利用白藜芦醇(Resveratrol，Res)对脂肪肝的防治作用[7]来对该模型进行治疗，从而验证造模成功，为进一步的临床研究提供实验动物模型。

1材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1实验动物近交系FVB/N小鼠，SPF级，6周龄，雌性，体重(22±3)g，共40只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[生产许可证号：SCXK(京)2014-0004]。小鼠饲养于室温(23±3)℃，相对湿度50%～70%的环境中。

1.1.2试剂与药物DH-5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)；康为世纪金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；FASN、HA、pAKT和β-actin抗体(美国Abcam公司)，白藜芦醇(Res，纯度98%，南京泽朗生物有限公司)。

1.1.3主要仪器电子天平(上海花潮电器有限公司)；核酸蛋白检测仪(美国ACTGene公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；Western blot及转膜设备(BioRad公司)；显影机(日本柯达公司)；高速离心机(Eppendorf公司5415D)。

1.2实验方法

1.2.1目的基因质粒构建用于小鼠注射的myr-AKT(用HA进行了标记)和pCMV/sleeping beauty transposase(SB)质粒按照文献[7-8]描述的方法构建，所有质粒均导入DH-5α感受态细胞进行扩增，使用康为世纪金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒抽提纯化。

1.2.2小鼠尾静脉高压注射方法尾静脉高压注射按照文献[9-10]描述的方法进行，将75 μg myr-AKT质粒和3 μg SB质粒置于2 mL生理盐水(0.9% NaCl)配置成溶液，将含有质粒的生理盐水溶液用0.22 μm滤器过滤，在5～7 s内通过小鼠尾静脉注射至体内。

1.2.3动物分组将40只6周龄健康雌性FVB/N小鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组(n=15)，模型组(n=15)，对照组(n=5)，治疗组(n=5)。正常组与模型组分别给予尾静脉高压注射生理盐水和AKT/SB质粒1次，于第1、2、3周分批处死，每批处死5只。对照组与治疗组给予尾静脉高压注射AKT/SB质粒1次，第3周治疗组开始予以白藜芦醇灌胃(0.04 g/kg)，对照组予以等量0.5% CMC-Na溶液灌胃，第5周处死全部对照组和治疗组小鼠，检测小鼠体重，肝湿重，肝指数，血清ALT、AST、TG、TC水平，肝组织TG、TC水平及肝组织中脂肪合成相关蛋白的表达水平，肝脏组织切片进行病理学观察。

1.3检测指标及方法

1.3.1病理学检查肝组织用4%多聚甲醛固定，由谷歌生物科技有限公司进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色与油红O染色。在显微镜下观察肝组织病理学变化，所有切片通过盲法阅片作出诊断，对肝脂肪变性和炎性细胞浸润程度分级、评分。肝脂肪变性根据脂滴细胞所占面积和总细胞所占面积的比值分为0、<1/3、1/3～2/3和>2/3，共4个等级，达到2级或以上即诊断为脂肪肝。炎症活动度分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)和桥接坏死(BN)4项分别评价，每项根据病变程度分别计1、2、3、4分，因为碎屑样坏死和桥接坏死严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。

1.3.2血清相关指标的测定ALT用赖氏法，TC用CHO酶法，TG用TG酶法，均采用试剂盒测定，由南京建成生物工程研究所提供，按照相关试剂盒的说明书操作。

1.3.3Western blot检测方法肝组织匀浆后在冰上用裂解缓冲液处理30 min，以12 000 r/min离心后收集上清液。细胞裂解物在10%丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1 h，然后分别孵育FASN、HA、AKT、p-AKT抗体4℃过夜。然后将膜在PBST(PBST中含有0.1%吐温20)洗涤3次，然后孵育二抗1 h。然后将膜洗涤4次，并通过ECL发光底物曝光显影，以β-actin作为内参，实验重复5次。

1.4统计学处理

2结果

2.1小鼠体重与肝指数变化

实验期间正常组小鼠活动度好，饮食正常，皮毛整洁；模型组小鼠嗜睡，毛色偏黄，3周后各组动物均有不同程度的精神萎靡，活动减少，皮毛凌乱的情况，各组间无显著性差异。模型组小鼠体重和肝指数与正常组小鼠相比均呈上升趋势，提示可能有脂肪肝的形成。白藜芦醇治疗组小鼠体重与对照组小鼠相比明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，这更进一步表明脂肪肝形成的可能性。实验结束时，各组小鼠全部存活。见图1。

图1　各组小鼠体重变化Fig.1 Changes of mouse body weight in each group

2.2小鼠肝脏组织形态学及病理变化

2.2.1肉眼观察正常组小鼠肝脏形态正常。模型组小鼠自第1周起肝脏外形稍饱满圆钝，出现白色的局灶性脂肪沉积；随着造模时间的延长，肝脏体积增大，切面油腻，实验结束时，可见肝脏明显增大，肝组织质地略软，颜色变黄，表面呈花斑状，所有小鼠肝脏均有黄白色的局灶性脂肪沉积(图2)。

2.2.2光镜观察正常组：肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰，胞核圆，位于细胞中央。1周模型组：肝小叶结构基本完整清晰，肝索放射状排列明显，部分肝细胞体积增大，胞质内充满大小不等的脂肪空泡，少部分细胞有明显的脂肪沉积；2周模型组：肝小叶结构不清晰，肝索放射状排列不明显，大部分细胞肿胀，细胞轮廓模糊，大部分细胞出现明显的脂肪沉积；3周模型组：肝索排列紊乱，肝细胞肿胀，呈中至重度脂肪变，炎症程度明显加重，部分小鼠肝脏出现多个炎症坏死灶，连接成片，但未见明显的肝纤维化发生(图2)。

与正常组比较，随着造模时间的延长，小鼠肝细胞脂肪变性及组织炎症进一步加重；而治疗组与相对应的对照组相比，肝组织脂肪变性程度及组织炎症范围明显减轻，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

肝脏形态与肝组织HE染色(×400)；A：正常组；B：1周模型组；C：2周模型组；D：3周模型组图2　小鼠肝脏组织形态学及病理变化Fig.2 Histomorphological and pathological changes of the liver in mice

组别例数肝脂肪变性程度(例)0级1级2级3级肝组织炎症程度(分)正常组5500001周模型组502301.34±0.38**2周模型组501312.13±0.26**3周模型组500235.02±1.45**对照组500234.86±0.96治疗组513101.42±0.73##

与正常组比较，**P<0.01；与对照组比较，##P<0.01

2.3脂肪肝模型小鼠肝脏生化指标检测

各组小鼠血清中相关生化指标含量的变化见表2。血清TC在造模1～3周期间，与相对应的正常组相比，明显有随时间的推移而逐渐升高的趋势，提示模型组小鼠肝脏出现硬化，胆固醇的酯化发生障碍。

各组小鼠肝功能指标ALT及肝指数的变化见表2。在肝细胞内，ALT主要分布于细胞胞质中，而AST 80%分布于线粒体内，少数分布于细胞胞质中。当肝细胞轻度损伤时即轻度变性、细胞膜通透性增加时，从细胞内逸出的主要是胞浆酶ALT，当肝细胞重度损伤时，线粒体内AST便释放至血清中。在本实验中，与正常组比较，各模型组ALT和肝指数升高，各个值随着造模时间延长而增高，部分具有统计学意义(P<0.05)。说明模型组小鼠造模2周后就出现肝功能损伤，且造模时间越长，损伤程度越严重。但小鼠肝功能指标AST与正常组基本持平，说明小鼠肝脏有一定肝功能损伤，但是损伤程度较轻，没有十分严重的肝脏病变。

与对照组相比较，灌胃给药白藜芦醇的治疗组小鼠肝脏较为鲜红，表面脂肪形成大大减少，边缘锐利，质软有弹性；HE染色和油红O染色也显示出治疗组小鼠肝脏中脂肪变性的肝细胞较对照组显著减少，见图3。治疗组ALT和肝指数也较对照组明显降低(P<0.05)(表2)。这些均表明白藜芦醇验证小鼠非酒精性脂肪肝模型构建成功。

表2　各组血清ALT、AST、TC、TG水平及肝指数比较

与正常组比较，*P<0.05**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05

A：肝脏形态；B：肝组织HE染色(×400，箭头指示为脂肪空泡)；C：肝脏油红O染色(×400，红色小点代表聚集的脂滴)；1：正常组；2：对照组(高表达AKT基因)；3：治疗组(使用白藜芦醇处理)图3　各组小鼠肝脏形态、肝组织HE染色和油红O染色图Fig.3 Gross examination of the live，and HE staining and Oil red O staining of live tissues in each group

2.4Western blot检测结果

通过Western blot方法检测小鼠肝细胞AKT和p-AKT蛋白表达水平，发现模型组与正常组相比，AKT和p-AKT蛋白得到过量表达(图4)，提示递送的AKT基因在模型小鼠体内成功过量表达。

对于小鼠肝细胞脂肪合成酶基因(FASN基因)的表达水平，我们发现模型组与正常组相比，基因FASN表达上调，即AKT基因诱导FASN基因表达上调，从而诱导脂质在肝脏累积。而白藜芦醇治疗组与模型组相比，AKT和p-AKT蛋白表达水平无明显差异(图4)，而只有FASN基因表达明显降低，即可得出白藜芦醇并不通过阻断AKT/mTOR通路，而是通过直接下调FASN基因表达水平抑制脂肪的从头合成，从而抑制肝脏脂肪合成代谢，继而起到治疗脂肪肝的作用。

3讨论

NAFLD是发展中国家最常见的肝脏疾病。据统计显示这种代谢综合征的特点是肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常，伴有肥胖和胰岛素抵抗。NAFLD的很多风险因素是明确的，但潜在的发病机制还不是很清楚。目前还没有有效的治疗方法可以根治NAFLD[11]。因此建立一个稳定可靠、病理演变过程相符的NAFLD动物模型，对研究NAFLD的发病机制及治疗方法具有重要意义[12]。

目前国内外已建立多种实验动物NAFLD模型，如通过高脂和(或)高胆固醇饲料喂养造成的营养失调性脂肪肝模型，禁食后摄入髙糖、高淀粉诱发脂肪肝、药物中毒性脂肪肝模型，全胃肠外营养造成的脂肪肝模型等，但这些模型均有其局限性，如营养失调性脂肪肝模型造模时间过长，需8～12周；禁食后摄入髙糖、高淀粉诱发脂肪肝不符合临床上脂肪肝的发病过程；药物中毒性脂肪肝模型动物死亡率高；全胃肠外营养造成的脂肪肝模型，虽然该模型与人类疾病相似，但由于操作复杂无法广泛推广应用[13-15]。

与常规建模方法相比，尾静脉高压注射法建立小鼠NAFLD模型仅需3周，具有简便、快速、经济等特点。它不同于普通的尾静脉注射，而是将大体积的裸质粒DNA溶液经小鼠尾静脉快速注入，引起小鼠一过性心衰，使注入液体由下腔静脉经肝静脉迅速返流入肝脏，使导入的DNA未能与血清中的核酸酶有效接触就可进入肝细胞，从而大大减少了核酸酶对DNA的降解作用[16]。且大量的质粒溶液可导致小鼠循环血量的急剧增加，超过其心脏负荷，使血液积聚在肝血窦中不能回流，延长了质粒DNA在肝窦中的停留时间，从而被肝组织细胞摄取[17]。Tada等[18]曾通过静脉导管将质粒DNA高压注射到大鼠的中央静脉，使肝组织有高水平的目的基因表达。这些研究表明了通过尾静脉高压注射质粒溶液可使目的基因在肝脏高效表达。

越来越多的证据表明：PI3K-AKT-mTORC1信号途径是脂肪合成的重要调节途径，是多种细胞活动的重要调节因子，包括细胞代谢、生长、增殖和存活。本实验使用的AKT基因和SB基因是通过PI3K-AKT-mTORC1信号途径来调控脂质代谢的。PI3K-AKT-mTORC1信号途径能够调节脂肪合成相关因子SREBP-1及其相关生酯酶的表达来调节脂质代谢。SREBP1通过转录激活葡萄糖到脂肪酸代谢的关键限速酶脂肪合成酶(FASN)使之表现出过表达从而来调控脂质合成。即AKT的激活可以引起从头脂肪酸合成的增加和细胞内脂质含量的显著增加[19-21]。所以在本实验中，我们采取尾静脉高压注射的方法使AKT基因在肝脏高效表达，通过上述信号途径引起小鼠肝脏细胞大量合成脂肪酸，使之在细胞中累积从而导致脂肪肝的形成。本法建模的机制是：通过尾静脉高压注射AKT基因，使其在肝脏高效表达，AKT基因通过PI3K-AKT-mTORC1信号途径调节脂肪合成相关因子SREBP-1，使之通过调控FASN基因过表达使肝细胞从头脂肪酸合成增加，脂质含量显著增加。致使小鼠肝功能损伤、脂质代谢紊乱，从而逐渐形成病变程度逐步加重的NAFLD。

本建模方法以肝脏组织形态学观察，HE染色、油红O染色等病理观察、血清生化指标、肝组织TG和TC含量检测作为小鼠建模是否成功的观测指标。模型组血清ALT和TC含量高于正常组。实验中病理组织检验结果，经判定符合疾病标准[22]。实验中血清的AST变化无显著差异，推断为AST主要存在于肝细胞线粒体内，只有当肝脏发生严重坏死或破坏时，才能引起谷草转氨酶在血清中浓度偏高。据此可推断我们构建的脂肪肝模型只是造成了肝组织的脂肪浸润，而没有严重破坏肝脏。而白藜芦醇具有增强肝细胞抗氧化能力、减少肝细胞脂质积聚、改善肝功能的作用，可作为NAFLD氧化损伤的调节剂，起到治疗作用[23]。本实验中治疗组小鼠肝脏组织的形态学、病理学及血清中生化指标的改善也可作为建模成功的佐证。

通过尾静脉高压注射AKT质粒的方法建立NAFLD小鼠模型用时短、死亡率低、成本低、与人类疾病特征相似，基本符合人类疾病自然发病规律，避免了其他改良方法的缺点，是一种可供今后科研和临床研究使用的较有价值的动物模型。

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(2015-07-20收稿)

Establishment of AKT Gene-mediated Non-alcoholic Fatty Liver Models in Mice

Yu Zhaoyang，He Yang，Luo Weietal

SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo establish a novel non-alcoholic fatty liver animal model by hydrodynamic injections of plasmids containing AKT/SB gene via the tail vein.MethodsForty FVB/N female mice were randomly divided into normal group(n= 15)，model group(n=15)，control group(n=5)and treatment group(n=5).Animals in normal group and model group were treated by hydrodynamic injections of normal saline and naked AKT/SB plasmids，respectively，via the tail vein.Every five mice in the two groups were killed at the 1st，2nd，3rd week，respectively.Mice in treatment group and control group were treated by hydrodynamic injections of naked AKT/SB plasmids through the tail vein and then treated with resveratrol(i.g 0.04 g/kg)and equal 0.5% CMC-Na solution，respectively，at the 3rd week.They were sacrificed in both control and treatment groups at the 5th week.The body weight，liver weight，serum ALT，AST，TC and TG levels and expression levels of protein related to lipid synthesis were measured.Liver tissues were obtained and histopathologically examined to evaluate the physiologic and pathological changes in different groups.ResultsAt 2 weeks，the liver function injury was found in mice in model group，the disorder of lipid metabolism occurred，and the hepatic steatosis was significantly increased.Besides，there were obvious inflammatory infiltration and fibrosis in model group.The lesions became severe with the time of modeling.The serum levels of ALT，AST and TG and adipogenesis-related protein levels were significantly decreased and the adipogenesis was markedly reduced in liver tissues in treatment group when compared with those in model group.ConclusionNon-alcoholic fatty liver disease models in FVB/N mice were successfully established by hydrodynamic injections of AKT/SB gene via the tail vein，and the lesions tended to gradually worsen within 3 weeks.

Key wordsnon-alcoholic fatty liver；hydrodynamic tail vein injections；FVB/N mice；AKT gene

中图分类号：R575.5

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.011

*华中科技大学大学生创新创业训练项目(No.81172653)

喻兆阳，男，1993年生，本科生，E-mail:yzyhans@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail:leileilesure@163.com