人脐带间充质干细胞来源外泌体的生物学特性研究*

杨向荣，　丁　娟，　徐正阳，　王　珏，　纪红梅，　李玉云

1蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心，蚌埠　2330302蚌埠医学院第一附属医院，蚌埠　233004 3蚌埠医学院医学检验教研室，蚌埠　233030



人脐带间充质干细胞来源外泌体的生物学特性研究*

杨向荣1，丁娟1，徐正阳1，王珏2，纪红梅1，李玉云3△

1蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心，蚌埠2330302蚌埠医学院第一附属医院，蚌埠2330043蚌埠医学院医学检验教研室，蚌埠233030

摘要：目的探讨正常人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs)分泌的外泌体(exosomes)的免疫调节功能及对恶性肿瘤细胞体外增殖的影响。方法采用组织贴壁法分离培养hUC-MSCs，收集第3～6代hUC-MSCs上清液，使用超速离心法分离纯化exosomes；通过电子显微镜观察exosomes形态并分析其直径和直径分布范围等特征；采用流式细胞仪检测其表面hUC-MSCs来源的CD44、CD73标志物。将exosomes与正常人外周血单个核细胞共培养，采用MTT检测exosomes对淋巴细胞增殖的影响，ELISA法检测上清液中IL-4和INF-γ的分泌量。选择慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株，加入exosomes共培养，应用MTT法、PI/AnnexinⅤ双染流式法检测exosomes对癌细胞体外生长增殖、凋亡的影响。结果组织贴壁法成功分离hUC-MSCs，传代后呈长梭状生长。电镜观察分离得到的exosomes为椭圆形膜性小囊泡，经统计得出其直径在6.8～78.1 nm之间，且分布比较集中。流式细胞术测得exosomes高表达黏附分子CD44(54.1%)与干细胞标志物CD73(31.5%)，MTT和ELISA检测结果表明，不同浓度的exosomes均抑制外周血单个核细胞增殖且抑制细胞因子IL-4和INF-γ的分泌，呈现剂量依赖性。体外实验表明exosomes对K562细胞株具有抑制增殖、促进凋亡的作用。结论hUC-MSCs来源的exosomes具有免疫调节作用及抑制K562细胞增殖的作用。

关键词：间充质干细胞；外泌体；免疫调节；增殖；凋亡

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs)是一类具有多向分化能力和自我更新能力的干细胞[1-2]。它在胚胎时期的第4～12天进入Wharton’s jelly并且活跃至胎儿娩出。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于hUC-MSCs的提取。同时，研究发现hUC-MSCs的体外扩增和多向分化能力比其他组织来源的MSCs更强[2-3]。

胞外体(exosomes)是一种由真核细胞分泌到细胞外的、直径约30～100 nm的膜性小囊泡，含有其来源细胞的胞膜、蛋白质、mRNA和微小RNA(miRNA)等成分，通过与邻近的细胞膜融合进而将一个细胞的胞内物质传递到另一个细胞，从而在不同细胞间进行信息传递[4]。以往的实验证明MSCs具有较好的组织损伤修复、机体免疫调节及促进新生血管的生长等作用[5]，那么其来源的exosomes可能也同样具有对淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的抑制作用。但是，国内对hUC-MSCs来源的exosomes的研究较少。本课题对hUC-MSCs来源的exosomes进行生物学特性研究，并对其免疫抑制和肿瘤抑制功能加以探索。

1材料与方法

1.1仪器及试剂

胎牛血清、细胞培养液DMEM/F12、青霉素、链霉素购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；PBS购自武汉博士德生物技术有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)及植物血凝素(PHA)购自Sigma公司；双染细胞凋亡检测试剂盒BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；0.22 μm无菌滤膜购自Salus公司；重水购自美国Cambridge Isotope Laboratories；CD-73 PE、CD-44PE购自BD公司；人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；改良Neubauer细胞计数板购自南京裕安公司；CX-201超净工作台(蚌埠净化设备厂)；CO2培养箱(日本三洋公司)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；ChemiDocXRS成像系统(美国BIO-RAD公司)；FEI Tecnai 12型透射电子显微镜购自Philips公司；IL-4和INF-γ ELISA检测试剂盒购自苏州卡尔文生物科技有限公司。

1.2细胞培养

无菌取足月剖宫产胎儿脐带，在超净台内用含有双抗的PBS清洗脐带3遍，洗去残存血液，剔除脐带动、静脉和外包膜并将其剪碎至1 mm3大小，均匀接种于一次性培养瓶中，使用含10%FBS的DMEM/F12的培养液置饱和湿度的37℃、5%CO2培养箱内培养。每隔3天更换1次培养液。培养约10 d左右即有成纤维状细胞从组织中爬出，待细胞长至80%融合时，使用0.25%胰蛋白酶消化传代，取生长良好的P3～P6代细胞进行实验。

1.3hUC-MSCs来源的exosomes的提取

将生长良好的P3～P5代hUC-MSCs在37℃、5%CO2的条件下使用无血清培养液培养48 h收集上清液。采用超速离心法，将培养上清液在4℃下300 g离心20 min去除死细胞，取上清液，于4℃条件下16 500 g离心20 min以去除细胞碎片及蛋白颗粒，将上清用0.22 μm滤膜除菌后，于4℃条件下120 000 g离心70 min，弃去上清，将得到的exosomes沉淀重悬于PBS中。以BCA法检测其蛋白浓度，调整其蛋白浓度为1 g/L，于4℃保存1周或于-80℃冰箱中长期保存。

1.4电镜观察细胞形态

取20 μL exosomes悬液滴于载样铜网光面上，室温条件下静置1 min，用滤纸从一侧吸干液体，滴加20 g/L的磷钨酸约20 μL于载样铜网上，室温负染1 min后滤纸吸干负染液，于白炽灯下烘烤约10 min，透射电镜下观察并拍照保存。

1.5流式细胞术检测exosomes表面标志

将分离纯化后的hUC-MSCs来源的exosomes与PE标记的鼠抗人CD73、CD44抗体室温避光孵育30 min，用PBS洗涤1遍后，用1%的多聚甲醛重悬，上流式细胞仪检测分析。

1.6MTT法检测hUC-MSCs来源的exosomes对淋巴细胞增殖的影响

取健康志愿者外周血10 mL，使用Ficoll分离液分离外周血单个核细胞，经计数后用含有10% FBS的RPMI-1640培养液调整细胞密度为1×106/mL备用。按每孔加入100 μL细胞悬液种于96孔板，然后加入终浓度为20 μg/mL的PHA(植物血凝素)以刺激淋巴细胞增殖。加入exosomes的剂量终浓度为1、10、50、100 μg/mL，以不加exosomes的孔作为阴性对照，另外以100 μL的PBS作为空白对照，每组均设3个复孔进行实验。于37℃、5%CO2的条件下培养72 h后每孔加入5 g/L MTT试剂20 μL，培养箱中继续培养4 h后，离心后吸弃上清，然后每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶颗粒完全溶解，酶标仪测定490 nm处吸光度(A)值，以对照组A值为100%得出各组相对抑制率。

1.7 ELISA检测exosomes对细胞因子分泌量的影响

收集上述5组阳性对照及exosomes和淋巴细胞培养的上清液，ELISA检测其中的IL-4和INF-γ的含量。具体操作方法参照IL-4和INF-γ试剂盒说明书。

1.8 hUC-MSCs来源的exosomes对K562细胞增殖、凋亡的影响

1.8.1 MTT法检测增殖抑制作用慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562细胞采用RPMI-1640培养液培养，调整细胞密度，以每孔加入100 μL细胞悬液(3 000～5 000个细胞)种于96孔板。加入exosomes的剂量终浓度为2.5、12.5、25、50 μg/mL，以不加exosomes的孔作为阴性对照，每组均设3个复孔进行实验。置于37℃、5%CO2的条件下72 h后每孔加入5 g/L MTT试剂20 μL，培养箱中继续培养4 h，离心后吸弃上清，然后每孔加入DMSO 150 μL，振荡15 min，使结晶颗粒完全溶解，酶标仪测定490 nm处吸光度(A)值。

1.8.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率根据MTT结果，选取25 μg/mL exosomes浓度为实验组浓度，进行凋亡分析。以每孔加入2 mL细胞悬液(40 000个细胞)种于6孔板，分实验组与对照组两组，加入exosomes后培养72 h，收集所有细胞至离心管中，2 000 r/min离心5 min，小心吸弃上清，再用预冷PBS清洗2次，离心沉淀，去上清，加入500 μL Binding Buffer使细胞悬浮，然后再加入Annexin Ⅴ-FITC及PI染液各5 μL，混匀。留出空白对照组和单染对照组，室温避光孵育10 min，流式上机检测。

1.9统计学处理

2结果

2.1hUC-MSCs的原代培养及形态观察

采用组织贴壁法原代培养hUC-MSCs约10 d左右，低倍镜下即可观察到形似成纤维样细胞从组织块中爬出，贴壁细胞的形态为多角形或梭形，培养约2～3周至细胞融合达到80%即可消化传代，细胞消化传代后呈鱼群样、长梭状生长(图1)。

A：组织贴壁法培养10 d后，成纤维样细胞从组织块中爬出；B：传代培养hUC-MSCs呈单个长梭形图1　hUC-MSCs的生长形态(×40)Fig.1 The morphology of hUC-MSCs(×40)

2.2hUC-MSCs来源的exosomes的形态观察

透射电子显微镜观察显示，hUC-MSCs来源的exosomes呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，大小不一，直径为6.8～78.1 nm，腔内显示低电子密度成分(图2)。

图2　透射电镜观察hUC-MSCs来源的exosomes形态Fig.2 The morphology of hUC-MSCs-derived exosomes observed by transmission electron microscopy

2.3统计软件分析exosomes半径、直径分布范围

通过测量电镜图片中236个exosomes颗粒的直径显示，hUC-MSCs来源exosomes的直径分布在6.8～78.1 nm的区间内，直径25%分位数为13.5 nm，直径75%分位数为18.7 nm，直径中位数为16.1 nm，直径平均数17.7 nm，标准误差为9.5。同时也证明，分步离心结合超速离心的方法，对分离提hUC-MSCs来源exosomes具有较为理想的效果。见图3。

2.4流式细胞术检测exosomes表面标志

如图4流式细胞仪检测结果显示hUC-MSCs来源的exosomes高表达粘附分子CD44(54.1%)和干细胞标志物CD73(31.5%)。

图3　脐带间充质干细胞来源exosomes的直径(nm)区间分布统计图Fig.3 Diameter distribution map of hUC-MSCs derivedexosomes(nm)

图4　exosomes的免疫表型Fig.4 The immunophenotype of exosomes

2.5hUC-MSCs来源的exosomes对淋巴细胞增殖的影响

不同浓度的hUC-MSCs来源的exosomes与经PHA刺激的淋巴细胞共培养3 d后，MTT法检测exosomes对淋巴细胞增殖的影响，如图5所示，不同浓度的exosomes均抑制外周血淋巴细胞的增殖，随着浓度的增加，抑制作用明显，显示剂量依赖性。

与对照组比较，*P<0.05图5　不同浓度exosomes对淋巴细胞增殖的影响Fig.5 The effects of different concentrations of exosomes on lymphocyte proliferation

2.6ELISA法检测exosomes对淋巴细胞分泌功能的影响

实验结果显示，经PHA刺激过后的淋巴细胞分泌IL-4达到(139.14±13.96)pg/mL，而加入终浓度为100 μg/mL exosomes后IL-4的浓度为(7.37±0.46)pg/mL。结果显示hUC-MSCs来源的exosomes可以显著降低外周血淋巴细胞分泌IL-4(P<0.01，n=3)。另外，未加入exosomes的经PHA刺激的淋巴细胞培养3 d后IFN-γ的浓度为(3 832.67±756.61)pg/mL，当加入终浓度为100 μg/mL的exosomes后IFN-γ的浓度为(269.00±7.66)pg/mL(P<0.01，n=3)。这些结果显示，hUC-MSCs来源的exosomes具有抑制外周血淋巴细胞分泌IL-4和INF-γ的免疫功能，且具有剂量依赖性。见表1。

2.7 hUC-MSCs来源的exosomes对K562细胞株体外增殖、凋亡的影响

2.7.1增殖抑制作用不同浓度的hUC-MSCs来源的exosomes与K562细胞株体外共培养3 d后，MTT法检测exosomes对其增殖的影响，如图6所示，不同浓度的exosomes均抑制细胞的增殖，随着浓度的增加，抑制作用明显。

表1不同浓度exosomes对淋巴细胞分泌IL-4和

Table 1The effects of different concentrations of exosomes

组别IL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)对照组139.14±13.963832.67±756.611μg/mL87.65±10.96**2605.33±684.3110μg/mL18.72±7.60**1156.33±557.14**50μg/mL14.49±1.78**441.33±139.84**100μg/mL7.37±0.46**269.00±7.66**

与对照组比较，**P<0.01

与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01图6　不同浓度的exosomes对K562细胞增殖的影响Fig.6 The effects of different concentrations of exosomes on K562 cells proliferation

2.7.2促凋亡作用hUC-MSCs来源的exosomes与K562细胞株体外共培养3 d后，流式上机检测exosomes对其凋亡的影响，如图7所示，exosomes具有促进K562细胞凋亡的作用，实验组的早期凋亡率(Q3：7.55%)、晚期凋亡率(Q2：5.09%)以及总凋亡率(Q2+Q3：12.64%)均高于对照组，且差异具有统计学意义。

图7　间充质干细胞来源exosomes对K562细胞凋亡的影响Fig.7 The effects of hUC-MSCs-derived exosomes on K562 cells apoptosis

3讨论

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)因来源和功能上的多重优势而成为干细胞研究中的热点。我们的前期研究显示，hUC-MSCs可以影响淋巴细胞和其他免疫细胞的功能，与淋巴细胞共培养时可以抑制其增殖[6-7]，并能降低淋巴细胞的分泌功能，这种作用可能同样存在于来源于其的exosomes上。

Exosomes是真核细胞内多泡体与来源细胞膜融合后分泌到细胞外的膜性小囊泡，直径约30～100 nm，含有来源细胞的脂类、蛋白及微小RNA等成分[8]，在细胞间信息传递发挥着重要作用[9]。Exosomes的功能取决于其来源细胞，如肿瘤细胞来源的exosomes可以携带相应的肿瘤抗原，具有抑制肿瘤发生和发展的作用[10]。

本实验采用超速离心法[11]成功分离纯化hUC-MSCs来源的exosomes，进行了形态学的观察和流式细胞学的检测，透射电子显微镜观察显示，hUC-MSCs来源的exosomes呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，大小不一，直径为20～100 nm，腔内显示低电子密度成分，流式细胞仪检测结果显示hUC-MSCs来源的exosomes高表达黏附分子CD44和干细胞标志物CD73，与其来源细胞hUC-MSCs的细胞表面标志相似。研究发现，hUC-MSCs来源的exosomes具有抑制细胞免疫反应的作用，这在肿瘤逃逸和诱导免疫耐受方面必定起一定的作用。以往研究表明，exosomes免疫抑制的机制可能包括：① Fasl阳性的exosomes能诱导T细胞的凋亡，而抗-Fasl能够阻断T细胞凋亡，这可能是一种由于膜结合的免疫抑制分子介导的免疫抑制作用[12]。②带有NKG2D配体的exosomes能够通过下调NK细胞上的NKG2D受体的表达量而起到免疫抑制的作用[13]。但免疫抑制作用具体的机制还有待进一步研究。

本实验采用MTT法检测不同浓度的hUC-MSCs来源的exosomes与经PHA刺激的淋巴细胞共培养体系中exosomes对淋巴细胞增殖的影响，结果显示不同浓度的exosomes均抑制外周血淋巴细胞的增殖，且具有剂量依赖性。所以我们认为hUC-MSCs来源的exosomes在体外环境中可能抑制T细胞的增殖和诱导T细胞的凋亡，从而发挥其具有hUC-MSCs相似的免疫抑制作用。为了进一步探明hUC-MSCs来源的exosomes对外周血淋巴细胞免疫功能的影响，我们采用ELISA法进一步检测不同浓度的exosomes与外周血淋巴细胞共培养3 d后上清液细胞因子的水平，结果表明共培养上清液中IL-4和INF-γ的浓度较对照组明显降低，同样具有剂量依赖性，说明hUC-MSCs来源的exosomes还能通过抑制Th细胞的功能，从而下调T淋巴细胞的免疫功能，对机体的免疫反应起着抑制作用。这也验证了hUC-MSCs来源的exosomes在抑制宿主抗移植物排斥反应，减轻局部的炎症反应，延长受体的术后生存时间方面具有重要意义[14]。

一系列研究表明，exosomes发挥其功能主要有3种机制，第一种是依赖膜表面信号分子的信息转运[15]。这种依赖于膜表面的信号分子的方式常见于免疫系统中。另一种是依赖于膜融合后的内容物释放发挥功能，当exosomes与细胞膜融合后，其内容物释放到细胞内发挥作用[16-17]。除了上述两种方式外，exosomes还可以通过释放内部的信号分子作用于细胞膜表面的受体，发挥其功能。本实验结果显示，hUC-MSCs来源的exosomes具有抑制K562细胞生长、促进其凋亡的作用，这可能与多种机制共同作用有关，具体作用方式尚待进一步探究。有研究结果表明MSC能保存肿瘤细胞的自我更新能力，影响恶性疾病的进程。临床上对恶性肿瘤患者大剂量应用MSC治疗方案可能会因此而造成肿瘤壁龛的形成[18]。但间充质干细胞来源的外体可能能够避免这种状况的发生。这对于研究肿瘤细胞在体内的增殖与迁移过程中间充质干细胞等基质细胞的作用也提供了重要的实验依据。

本实验所用的hUC-MSCs来源的exosomes表现出抑制外周血淋巴细胞的增殖，同时也降低了其分泌细胞因子IL-4和INF-γ的水平，还能抑制血液系统肿瘤细胞的生长，促进其凋亡，说明其具有多种方式的免疫抑制作用和抑瘤作用，然而具体机制和应用还需要进一步的探索。从某种意义上说，细胞分泌exosomes可以看作是机体的另一种调节方式。目前，exosomes的研究逐步应用于临床，但是还有许多问题需要解决，如需要进一步实验证明exosomes应用于临床的安全性，明确exosomes中各种物质的成分及作用机制，如何快速获得纯度较高的exosomes，以及临床使用的剂量等问题。但是，随着对exosomes研究的深入，hUC-MSCs来源的exosomes可能会成为临床治疗的一颗“新星”，对“无细胞”干细胞治疗提供新的思路。

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(2015-09-29收稿)

Biological Characteristics of Exosomes Secreted by Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stromal Cells

Yang Xiangrong，Ding Juan，Xu Zhengyangetal

ClinicalLaboratoryandDiagnosticCenterofBengbuMedicalCollege，Bengbu233030，China

AbstractObjectiveTo investigate the immune-regulatory function of exosomes secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and their effect on in vitro proliferation of tumor cells.MethodshUC-MSCs were isolated by tissue adhesion method and cultured.The supernatants of hUC-MSCs at 3rd，4th，5th and 6th passage were harvested for isolation and purification of exosomes by using ultracentrifugation.The electron microscopy was used to observe the morphology of exosomes and analyze their features such as the diameters of exosomes and the diameter distribution range.The immunophenotype of CD44 and CD73 on hUC-MSCs was detected by flow cytometry.Additionally，the exosomes were cultured with peripheral blood lymphocytes and their effect on lymphocyte proliferation was measured by MTT assay.The production of IL-4 and INF-γ from the co-culture system was detected by ELISA.Chronic granulocytic leukemia cells K562 were treated with exosomes for 72 h，and then the effects of exosomes on tumor proliferation and apoptosis were assessed by MTT and Annexin Ⅴ-FITC/PI.ResultshUC-MSCs were successfully separated from tissues by tissue adhesion method and they grew spindle-shaped after passage.The electron microscopy revealed that the exosomes were elliptical membrane vesicles with their diameter at 6.8-78.1 nm，and their distribution was in a concentrated manner.Flow cytometry showed high expression of the adhesion molecule CD44(54.1%)and the stem cell marker CD73(31.5%)on hUC-MSCs.MTT and ELISA showed that exosomes at different concentrations could inhibit the proliferation of peripheral blood lymphocytes and the secretion of cytokines IL-4 and INF-γ and the effect was in a dose-dependent manner.Furthermore，in vitro experiments showed that exosomes from hUC-MSCs could suppress the growth of tumor cells and promote their apoptosis.ConclusionhUC-MSC-derived exosomes have immune-regulatory functions and they can inhibit the proliferation of K562 cells.

Key wordsmesenchymal stem cells；exosomes；immunomodulatory；proliferation；apoptosis

中图分类号：R329

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.008

*蚌埠医学院研究生科研创新计划(No.Byycx1409)；安徽省大学生创业创新项目(No.AH201410367024)

杨向荣，女，1989年生，硕士研究生，E-mail：996929735@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：bbmcyxr@sina.com