Box-BehnKen响应面法优化紫穗槐根中总异黄酮提取工艺

2016-06-01赵昱玮南敏伦司学玲赫玉芳

中成药 2016年5期

赵昱玮，南敏伦，于　淼，司学玲，吕　娜，赫玉芳*

（1.吉林省中医药科学院，吉林长春130012；2.长春三德天晟科技有限公司，吉林长春130012；3.修正药业长春高新制药有限公司，吉林长春130012；4.吉林农业大学，吉林长春130118）

赵昱玮1，南敏伦1，于淼2，司学玲3，吕娜4，赫玉芳1*

摘要：目的优化紫穗槐根中总异黄酮的提取工艺。方法以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷为指标，采用紫外分光光度法测定总异黄酮含有量。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法研究乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对紫穗槐总异黄酮提取率的影响。结果最优提取工艺为乙醇体积分数70％，料液比1∶13，提取时间3 h，提取次数3次。在此条件下，紫穗槐根总异黄酮的提取率为5.59％。结论该工艺简便可靠，提取率高，可为紫穗槐根中总异黄酮的开发利用奠定基础。

关键词：紫穗槐；根；总异黄酮；提取工艺；Box-Behnken响应面法

紫穗槐AmorPha fruticosa L.为豆科紫穗槐属多年生落叶灌木，别名棉槐、椒条、棉条、穗花槐［1］，在我国东北、华北、西北地区及山东、安徽、江苏、河南、湖北、广西、四川等地均有栽培，其花清热、凉血、止血［2］；叶微苦、凉，具有祛湿消肿功效，主治痈肿、湿疹、烧烫伤［3］。紫穗槐根系发达，可耐瘠、耐水湿，又有固氮、防风固沙等作用［1］，其化学成分以黄酮为主，此外还含二苯乙烯苷、甘油酯、挥发油及多糖等［4-5］，在抗肿瘤、抗病毒、保肝、杀虫等方面显示出潜在的药用价值［6-7］。该资源比较丰富，但尚无其总异黄酮提取工艺的报道。

本实验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数为自变量，总异黄酮提取率为因变量，利用Box-Behnken响应面法优化提取工艺，以期为紫穗槐根中总异黄酮的提取与开发提供实验依据。

1 仪器与试药

UV-759S型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS2010S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；RE52-98型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；KQ-100型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）；ZK-82A型电热真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）。

毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，含有量> 98％）。甲醇、无水乙醇、95％乙醇均为分析纯（北京化工厂）；水为娃哈哈纯净水。

紫穗槐根采自长春净月开发区，经吉林省中医药科学院赵全成研究员鉴定为豆科植物紫穗槐AmorPha fruticosa L.的根。

2 方法与结果

2.1 总异黄酮的测定［8-9］

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.1 mg/mL对照品溶液。

2.1.2 检测波长的选择吸取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，在200～400 nm波长范围内扫描，发现在260 nm处有最大吸收峰，故选择其作为检测波长。

2.1.3 标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，于260 nm波长处测定吸光度，空白溶液作为对照。以各对照品的质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A），得到线性回归方程为A=0.052 68 X +0.081 43，r=0.999 4，表明毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在5～25 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 含有量的测定方法取供试品溶液适量，于260 nm波长处测定吸光度，标准曲线法计算紫穗槐根提取液中总异黄酮的含有量，计算公式如下。

注：X为总异黄酮提取率（％），c为总异黄酮质量浓度（μg/mL），m为取样量（g）

2.1.5 供试品溶液的制备将紫穗槐根药材粉碎，过40目筛，精密称取适量，乙醇回流提取，放冷，滤过，定容于250 mL量瓶中，再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

乡镇电视台取材范围狭窄。在取材不足的情况下，电视台主要把新闻焦点聚焦在时政方面，其中又以县级领导干部和正常政务活动的镜头为主；而对于那些能够反映基层群众日常生活、思想风貌、生存环境和社会心声的民生类新闻的比重较少。新闻报道内容单一，总体价值不高，这些与百姓利益没有直接性关系的会议新闻观众不感兴趣，影响了收视率。

2.1.6 精密度试验取同一供试品溶液适量，平行测定6次，测得RSD为1.8％，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验取同一供试品溶液适量，制备6份样品进行测定，测得RSD为1.5％，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验取同一供试品溶液适量，在0、1、2、4、6、8、10 h进行测定，测得RSD为1.4％，表明溶液在10 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验精密吸取含有量已知的供试品溶液6份，分别加入对照品溶液，按“2.1.4”项下方法进行测定，测得平均回收率为99.8％，RSD为1.9％，表明该方法回收率良好。

2.2 提取条件的确定

2.2.1 乙醇体积分数精密称取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在料液比1∶12，回流提取2次，每次1 h，50％、60％、70％、80％、90％乙醇条件下提取，放冷，滤过，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”项下方法在260 nm波长处测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为4.27％、5.12％、5.46％、5.48％、5.33％，故选择70％乙醇作为提取溶剂。

2.2.2 料液比精密称取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，回流提取2次，每次1 h，料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16条件下提取，放冷，滤过，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”项下方法在260 nm波长处测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为4.38％、5.02％、5.56％、5.49％、5.50％，故选择料液比为1∶12。

2.2.3 提取时间精密称取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，料液比1∶12，回流提取2次，提取0.5、1、2、3、4 h条件下提取，放冷，滤过，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”项下方法在260 nm波长处测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为4.21％、4.85％、5.51％、5.55％、5.53％，故选择提取时间为2 h。

2.2.4 提取次数精密称取紫穗槐根粉末5.0 g，共4份，在70％乙醇，料液比1∶12、提取2 h，提取1、2、3、4次条件下提取，放冷，滤过，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”项下方法在260 nm波长处测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为4.82％、5.48％、5.52％、5.61％，故选择提取次数为2次。

2.3 响应面法优选最佳提取条件结合单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面法进行试验设计，以紫穗槐根总异黄酮提取率为响应值（X），选择乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）这4个因素，设计4因素3水平，并采用Design-Expert8.0.6软件进行设计与分析［10-11］。因素水平见表1。结果见表2。

表1　因素水平

表2　响应面试验结果

然后，利用Design-Expert8.0.6软件进行分析，得到回归方程X=5.43 +0.19A+0.10B+0.18C+0.23D-0.027AB-0.045AC -0.11AD -0.012BC -0.092BD + 0.15CD-0.21A2-0.10B2-0.15C2-0.26D2。方差分析见表3。

由表3可知，一次项中，乙醇体积分数、提取时间、提取次数对总异黄酮提取率的影响最大，p均<0.000 1；二次项中，提取次数影响最显著，乙醇体积分数、提取时间次之，p均<0.01。另外，模型的失拟项不显著（p = 0.001 8），而模型显著（p<0.000 1），表明方法可靠；信噪比值为13.779，大于4，表明该模型能如实反映试验结果；相关系数r=0.928 0，表明回归方程的拟合程度良好；RSD低于10％（2.26％），表明试验稳定性良好。

表3　方差分析

综上所述，紫穗槐根总异黄酮的最优提取工艺条件为乙醇体积分数71.96％，料液比1∶12.27，提取时间2.90 h，提取次数2.62次，理论提取率值5.61％。

2.4 验证试验考虑到实际可操作性，对上述条件进行了修正，最终确定最优工艺为乙醇体积分数70％，料液比1∶13，提取时间3 h，提取次数3次。然后，以其进行验证试验，测得紫穗槐根总异黄酮的平均提取率为5.59％，平均含有量为20.3％，与理论值（5.61％）相近，表明该工艺参数准确可靠。

3 讨论

Box-Behnken响应面法可得到最优的考察因素和响应值，避免传统数理统计存在的问题，最终精确找到最佳点，并可灵敏地考察各因素间的交互作用［12］，弥补正交设计的缺限，具有试验次数少、周期短、回归方程精度高、结果直观等优点［13-14］。

本实验提取紫穗槐根总异黄酮后，先采用单因素试验考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对其提取率的影响，然后进行Box-Behnken试验设计，最后以Design-Expert8.0.6软件进行数据回归和方差分析，测得回归方程的相关系数为0.928 0，表明方程拟合良好。根据响应曲面及等高线图，得到了各因素间的相互作用，可知其影响大小依次为提取次数>乙醇体积分数>提取时间>料液比。

验证试验表明，该方法真实可信，误差小。最终，确定最优工艺为乙醇体积分数70％，料液比1∶13，提取时间3 h，提取次数3次，在此条件下紫穗槐根总异黄酮提取率为5.59％，总异黄酮平均含有量为20.3％，高于单因素试验结果，可为紫穗槐根中总异黄酮的开发利用奠定基础。

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*通信作者：赫玉芳（1973—），女，博士，副研究员，从事植物化学研究与新药开发，Tel：（0431）86058683，E-mail：hyf_ 1992@ 163.com

作者简介：赵昱玮（1983—），男，硕士，从事植物化学研究与新药开发。Tel：（0431）86058683，E-mail：yuwei5208@163.com

基金项目：吉林省中医药科技项目（2014 -Q40）