淫羊藿水提取物联合抗菌药对耐药大肠杆菌的体外抑制效果

胡梅 梁政 黎天良 秦风伟 罗远燕 吴永继 刘增援 赵雨川 司红彬

摘要：【目的】探究淫羊藿水提取物联合抗菌药对耐药大肠杆菌的体外抑菌效果，为兽医临床中西联合用药提供参考依据，也为中药在抑制耐药菌株上的开发研究打下基础。【方法】采用二倍微量肉汤稀释法测定淫羊藿水提取物及各抗菌药对产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC），然后以微量肉汤棋盘稀释法测定淫羊藿水提取物与抗菌药联用后的部分抑菌浓度指数（FICI）。【结果】淫羊藿水提取物与粘杆菌素、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素联用后能有效降低药物的MIC，对应的MIC均降低4倍以上，联合用药的FICI分别为0.13、0.26、0.26、0.25、0.51、0.51、0.50、0.75、0.75和0.75，对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果表现出协同或相加作用；以其联合诱导产ESBLs大肠杆菌传代，从第1代即能明显降低这些抗菌药的MIC，且稳定至第3代。【结论】淫羊藿水提取物与粘杆菌素、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素联用是通过协同或相加作用而提高抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，但不宜与磺胺类、喹诺酮类联合用药。

关键词： 淫羊藿；抗菌药；产ESBLs大肠杆菌；联合用药；抑制效果

中图分类号： S853.75 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1778-06

0 引言

【研究意义】近年来，因抗生素广泛及不合理使用带来的负面效应致使多种细菌的耐药性不断增强，进而导致临床治疗失败、感染复发、死亡率增加等（刘芬和姜成，2009）。同时，被耐药菌污染的动物源性食品也会对人类健康造成极大威胁。在规模化生产养殖过程中，动物肠道疾病多发，治疗药物仍以抗生素为主，长期低剂量用药极易导致动物肠道内正常菌群在抗菌药的压力下产生耐药性，尤以大肠杆菌最突出。β-内酰胺类抗生素在兽医临床抗感染治疗中使用最广泛，随着第三代头孢菌素的开发普及，细菌耐药种类进一步增多。超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）是介导第三代头孢菌素耐药的主要机制之一，同时对青霉素类、单环β-内酰胺类抗生素均表现出耐药性（司红彬等，2015）。因此，如何有效控制产ESBLs大肠杆菌感染与蔓延已成为当前兽医工作的新重点。【前人研究进展】我国中药资源丰富，且中药不易产生药物残留，不易产生耐药性，毒副作用小，价格低廉，具有极大的发展潜力和广阔的应用前景（郑红青等，2011）。淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）为小檗科（Berberidaceae）淫羊藿属（Epimedium）多年生草本植物（高泽梅等，2014），其作为滋补类中药，具有强筋骨、祛风湿、抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤等功效，为最具开发潜力的中药之一，也是国际上多年来重点研究的药用植物（李作洲等，2005）。早在1935年就有学者开始对该属植物进行较详细的化学成分研究，分离获得各类化學成分约130种，包括黄酮类、多糖类、生物碱、木脂素、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、酚苷类、紫罗酮类、乙醇苷类等（李牡丹等，2009）。随着中药药理学的不断发展，人们对淫羊藿药理作用的研究也逐渐深入到细胞、亚细胞和基因水平（孟宁等，2010）。濮祖茂等（2004）研究表明，淫羊藿具有能促进骨髓细胞DNA合成、组织蛋白合成及骨细胞生长等作用；蒋春茂等（2015）研究表明，淫羊藿多糖对鸡胚成纤维细胞的安全浓度为312.5 μg/mL，无论是单独使用还是协同植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）均能有效刺激外周血T淋巴细胞或脾脏B淋巴细胞，不同程度地增强淋巴细胞活性。此外，李花（2008）对淫羊藿药理作用、王文龙等（2011）对其提取工艺、孙娥等（2014）对其炮制工艺等分别进行了相关研究。【本研究切入点】目前已有研究证实，中西药联合用药既能减少药品用量、提高治疗效果，又可减少不良反应现象，甚至能逆转细菌对一些抗生素的耐药性（王静和张淑文，2007；宋剑武等，2014；刘增援等，2015；吴永继等，2015），已成为治疗产ESBLs细菌感染的一个新方向，但至今有关淫羊藿提取物与抗菌药联用抑制产ESBLs大肠杆菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】探究淫羊藿水提取物联合抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的体外抑菌效果，以期为兽医临床中西联合用药提供参考依据，也为中药在抑制耐药菌株上的开发研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

淫羊藿购自广西佰政药业有限公司；产ESBLs大肠杆菌由广西大学动物科学技术学院中兽医实验室保存提供；头孢曲松、阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、磷霉素、粘杆菌素、乙酰甲喹、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶、加替沙星、头孢他啶、林可霉素、头孢噻呋、氟苯尼考均在有效期内；肠杆菌科生化鉴定管、MH琼脂、MH肉汤、麦康凯琼脂、营养肉汤等培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1. 2 产ESBLs大肠杆菌检测

1. 2. 1 ESBLs初筛 按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的ESBLs标准纸片扩散法进行筛选。将分离获得的疑似产ESBLs菌株涂布于MH琼脂培养基上，37 ℃培养16～18 h，检测受试菌的抑菌环直径是否满足头孢他啶（CAZ 30 μg/片）≤22 mm，氨曲南（AZM 30 μg/片）≤27 mm，头孢噻肟（CTX 30 μg/片）≤

27 mm，头孢曲松（CRO 30 μg/片）≤25 mm，若满足上述抑菌直径要求即可初步判定产ESBLs。

1. 2. 2 ESBLs表型确证 按CLSI推荐的标准纸片扩散法对初筛菌株进行ESBLs表型确证，具体操作参照宋剑武等（2014）的方法。

1. 2. 3 产ESBLs大肠杆菌基因型检测 参照GenBank中登录的TEM、CTX-M、OXA-10、SHV基因序列，利用Primer Premers 5.0分别设计PCR扩增引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。因后期进行药敏试验，发现该受试菌株对磷霉素具有较高的耐药性，故同时进行fosA3基因型检测。PCR反应体系25.00 μL，即DNA模板2.00 μL，上、下游引物各1.00 μL，10×Easy Taq Buffer 2.50 μL，10 mmol/L High Pure dNTPs 0.50 μL，Easy Taq DNA聚合酶0.25 μL，去离子水补足至25.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，在各自退火温度（TEM基因52.5 ℃，CTX-M基因55.0 ℃，OXA-10基因52.5 ℃，SHV基因56.5 ℃，fosA3基因55.0 ℃）下退火30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外凝胶成像系统上观察结果，同时将阳性扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果用BLAST进行比对分析。

1. 3 淫羊藿水提取物制备

取淫羊藿干燥粗粉100 g，加入10倍量的蒸馏水浸泡过夜，大火煮至沸腾并保持1 h，过滤收集滤液；同样方法再依次加入8倍量与6倍量的蒸馏水反复提取2次，合并3次滤液，浓缩至100 mL，此时药物浓度为1 g/mL，高压灭菌后冷藏备用。

1. 4 淫羊藿水提取物与抗菌药联合用药试验

1. 4. 1 单药最小抑菌浓度（MIC）测定 采用二倍微量肉汤稀释法测定淫羊藿水提取物及各抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1. 4. 2 淫羊藿水提取物与各抗菌药的体外联合用药试验 采用微量方阵棋盘法设计，调整菌液浓度为1×106 CFU/mL，接种于96孔无菌培养板，在纵横两个方向上对两种药物分别进行倍比稀释，37 ℃下振荡培养16～18 h，观察淫羊藿水提物与抗菌药联合用药对产ESBLs大肠杆菌的MIC，计算其部分抑菌浓度指数（FICI），并根据宋剑武等（2014）的方法进行判读。FICI≤0.50为协同作用，0.502.00为拮抗作用。

2 结果与分析

2. 1 ESBLs的初筛和表型确证结果

按CLSI推荐的ESBLs标准对疑似产ESBLs菌株进行初筛，结果发现其抑菌环直径分别为：头孢他啶15 mm、氨曲南13 mm、头孢噻肟17 mm、头孢曲松14 mm，符合筛选标准。进而对该菌株进行表型确证试验，结果显示头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸的抑菌环直径分别为15、23、17和23 mm；头孢他啶和头孢噻肟两种药物添加克拉维酸后，二者的差值均>5 mm，表明该菌株为产ESBLs大肠杆菌。

2. 2 产ESBLs大肠杆菌基因检测及测序结果

对产ESBLs大肠杆菌进行基因检测，其PCR扩增电泳结果（图1）显示，仅扩增获得fosA3和TEM基因的对应条带，而未发现有CTX-M、SHV和OXA基因条带。对该菌株进行测序，再用BLAST进行比对分析，结果发现该菌株所含的TEM基因与KM598665.1的同源性为100%，fosA3基因与NG_041568.1的同源性为99%。

2. 3 淫羊藿水提取物联合抗菌药的微量方阵棋盘法结果

由表2可知，淫羊藿水提取物与大部分抗菌药（粘杆菌素、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素）联用后能有效降低药物的MIC，对应的MIC均降低4倍以上，尤其是头孢类抗菌药，在联合用药后能很大程度地抑制产ESBLs大肠杆菌，联合用药的FICI分别为0.13、0.26、0.26、0.25、0.51、0.51、0.50、0.75、0.75和0.75，表现出协同或相加作用；但淫羊藿水提取物与喹诺酮类抗菌药表现出拮抗作用，致使喹诺酮类抗菌药的MIC增大。

2. 4 淫羊藿水提取物与抗菌药联合诱导产ESBLs大肠杆菌传代结果

由表3可知，淫羊藿水提取物与粘杆菌素、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素联合诱导产ESBLs大肠杆菌传代，第1代即能明显降低这些抗菌药的MIC，且稳定至第3代；与磺胺间甲氧嘧啶联合连续诱导3代，仍未能降低磺胺间甲氧嘧啶的MIC；与环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星联合诱导传代，发现第1、2代产ESBLs大肠杆菌对这些抗菌药的MIC升高至原来的2倍，但第3代又恢复到原来的MIC水平；与加替沙星联合诱导传代，第1代产ESBLs大肠杆菌对加替沙星的MIC保持不变，但从第2代开始逐渐降低。

3 讨论

β-内酰胺类抗菌药物是目前使用最广泛的一类抗菌药，但ESBLs的产生使得大肠杆菌产生了多重耐药性，对头孢菌素类、林可胺类、氨基糖苷类、酰胺醇類等抗菌药均有较强的抵抗能力（刘立新等，2008）。生产中为了抑制产ESBLs病菌，通常采取加大抗菌药剂量的措施，其结果却进一步增强了细菌的耐药性。中药发展历史悠久，且具有不易产生耐药性、无残留、毒副作用小等优点（郑红青等，2011）。淫羊藿含有多种有效成分，其中淫羊藿苷被认为是特征成分，同时含有酚苷类、紫罗酮类、苯乙醇苷类、木脂素、多糖、有机酸、生物碱和微量元素等（李牡丹等，2009）。近年来，针对淫羊藿药理作用的研究已逐渐深入到细胞、亚细胞和基因水平（孟宁等，2010），并证实淫羊藿除了能促进骨髓细胞DNA合成、骨细胞生长外，还具有促进血液循环、提高免疫力、抗癌、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳及抑菌作用（付亮等，2012）。尽管目前有关淫羊藿药理作用的研究较多，但针对淫羊藿抑制产ESBLs大肠杆菌的研究尚无报道。

本研究使用淫羊藿水提取物联合抗菌药对产ESBLs大肠杆菌进行体外抑菌试验，结果表明，淫羊藿水提取物与抗菌药联用可選择性地增强药效，如与粘杆菌素、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素联用能有效降低药物的MIC，很大程度地抑制产ESBLs大肠杆菌，表现出协同或相加作用，且经联合诱导传代后均能明显降低抗菌药的MIC；但与磺胺间甲氧嘧啶、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星、环丙沙星联用表现出无关或拮抗作用，经联合诱导传代后并不能降低抗菌药的MIC，甚至增加抗菌药的MIC。可见，并不是所有的抗菌药都适宜与淫羊藿水提取物联合用药。本研究仅通过体外抑菌试验探讨淫羊藿水提取物联合抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，有关其抑菌机理及如何调动机体的积极因素发挥药效尚不明确，均有待进一步研究。

4 结论

淫羊藿水提取物与粘杆菌素、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素联用是通过协同或相加作用而提高抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，但不宜与磺胺类、喹诺酮类联合用药。

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（责任编辑 兰宗宝）