黑格尔七彩神仙鱼摩氏摩根菌分离鉴定及耐药性分析

王磊 孙培英 陈再忠 罗小溪 高建忠 李仲璞 韩灵莉

摘要：【目的】对患病七彩神仙鱼进行摩氏摩根菌（Morganella morganii）分离鉴定及药敏试验，为七彩神仙鱼养殖过程中摩氏摩根菌感染的临床诊断和科学用药提供科学依据。【方法】从患病野生黑格尔七彩神仙鱼体表分离病原菌，然后对其进行形态观察、生理生化指标测定及16S rDNA序列分析，并采用纸片扩散法（K-B）进行药敏试验。【结果】从患病野生黑格尔七彩神仙鱼分离获得一株优势菌株（DS2015），该菌为革兰氏阴性杆菌，其生理生化测定结果与摩氏摩根菌的相似度达100%。菌株DS2015的16S rDNA序列1208 bp（GenBank收录号KR866070），由基于16S rDNA序列构建的系统发育进化树可知，菌株DS2015与摩氏摩根菌聚为一簇，Bootstrap检验值为99；Biolog微生物自动鉴定结果也显示，菌株DS2015最具可能性为摩氏摩根菌。药敏试验结果表明，菌株DS2015对庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等抗生素高度敏感，对米诺环素中度敏感，对青霉素G、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、红霉素、克林霉素、万古霉素和呋喃唑酮等抗生素已产生耐药性。【结论】摩氏摩根菌可引起七彩神仙鱼身体发黑、皮肤大量分泌黏液及鳍条溃烂等症状，严重者甚至引起死亡，生产中可选用庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等抗生素进行防治。

关键词： 七彩神仙鱼；摩根氏菌；分离鉴定；药敏试验

中图分类号： S941.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1772-06

0 引言

【研究意义】七彩神仙鱼（Symphysodon spp.）隶属于慈鲷科（Cichlidae）盘丽鱼属（Symphysodon），原产于南美亚马逊河流域（刘晓东和陈再忠，2008），因其体色鲜艳夺目、花纹变幻，被誉为热带鱼之王（Giovanetti and Lucanus，2001）。近年来，我国七彩神仙鱼虽已实现人工养殖，但每年仍需从原产地进口大量野生鱼种进行品系改良，以期对退化的七彩神仙鱼种质资源进行复壮。进口野生七彩神仙鱼价格昂贵，是人工养殖七彩神仙鱼价格的十余倍，且死亡率极高，严重挫伤七彩神仙鱼养殖户的生产积极性，对其产业发展构成严重威胁（孙悦等，2013）。此外，七彩神仙鱼对水质要求较高（适宜生活水温28～32 ℃，pH 5.5～6.5，硬度1.4～1.8 mmol/L），饲养管理稍有不慎就会引起代谢紊乱、免疫力下降，且其体表鳞被较细、黏液分泌丰富，极易感染各种细菌性、真菌性和寄生虫性疾病（Onal et al.，2011；EI-Ghany et al.，2014）。因此，加强七彩神仙鱼的病害研究对促进其养殖产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】细菌性病原感染是七彩神仙鱼运输和养殖过程中的常见疾病，但至今关于七彩神仙鱼细菌性疾病方面的研究极少，仅EI-Ghany等（2014）报道了嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）可引起七彩神仙鱼感染发病。摩氏摩根菌（Morganella morganii）隸属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）摩氏摩根菌属（Morganella）。一般认为摩氏摩根菌是腐生菌，通常存在于人类和其他动物的粪便及污水、土壤中，特别是动物蛋白腐烂的地方（李雪峰和王利，2015），为条件性致病菌，可感染多种养殖动物而致病，我国已从多种患病动物上分离到该菌，包括锦鲤（陆小萏等，2005；韩娜娜等，2013）、袋鼠（赵耘等，2010）、黄喉拟水龟（黎小正等，2010）、中华鳖（孔蕾等，2013）等。陆小萏等（2005）和韩娜娜等（2013）报道，摩氏摩根菌可引起锦鲤肌肉充血、溃疡，严重者甚至引起死亡。黎小正等（2010）研究发现，摩氏摩根菌可引起养殖黄喉拟水龟发病死亡，临床症状表现为食欲减少、流鼻涕、嘴角有渗出物、口腔溃疡、眼睛有分泌物。李瑞伟等（2014）报道，摩氏摩根菌可引起中国大鲵腹部膨胀，体表有出血点，解剖后发现患病大鲵腹腔有大量积水，肝脏出血，肾脏失血发白，肠壁毛细血管充血。李雪峰和王利（2015）研究表明，鲈鱼感染摩氏摩根菌后其鳞片脱落，鳍基及鱼体两侧轻度出血，肛门红肿，脾脏肿大。【本研究切入点】目前，有关摩氏摩根菌感染引起七彩神仙鱼发病的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对患病七彩神仙鱼进行摩氏摩根菌分离鉴定及药敏试验，以期为七彩神仙鱼养殖过程中摩氏摩根菌感染疾病的临床诊断和科学用药提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

患病黑格尔七彩神仙鱼由上海某七彩神仙鱼进口商从巴西亚梦达河（Rio Nhamunda）流域进口（图1），其临床症状表现为鳍条溃烂，体表黏液脱落，呼吸急促，食欲不振等。健康七彩神仙鱼由上海海洋大学水产与生命学院观赏水族实验室自行繁殖获得，体长7.2±0.4 cm，体重23.54±2.15 g。细菌生化反应微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1. 2 细菌分离纯化

用无菌棉签在鱼体表刮取受伤部位的黏液，稀释后接种于营养琼脂培养基上，（28.0±0.5）℃培养24 h后挑取单个菌落，纯化2次以获得纯培养菌株（命名为DS2015）。观察分离培养菌落形态特征，并进行革兰氏染色、显微镜检，观察细菌的形态和染色特征，将纯化的菌株接种于试管斜面培养基保存、备用。

1. 3 生理生化及药敏试验

采用细菌生化反应微量鉴定管进行菌株DS2015的各项生理生化指标测定，并以纸片扩散法（K-B）进行药敏性试验。将菌株DS2015接种于新鲜营养肉汤培养基，（30.0±0.5）℃下摇床（200 r/min）培养24 h后用生理盐水稀释至OD=0.6左右，取200 μL新鲜菌悬液（浓度约1×107 CFU/mL）均匀涂布于BHI培养基上；在无菌操作下，将10类20种常用抗生素的抗药敏纸片均匀贴在BHI培养基上，每种抗药敏纸片3个重复，（30.0±0.5）℃培养24 h后测量抑菌圈直径。

1. 4 16S rDNA的PCR扩增及测序分析

将营养肉汤培养过夜的菌株8000 r/min离心2 min后，用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA。用于PCR扩增的引物为通用引物（正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系50.0 μL，即PCR Master Mix（2×） 25.0 μL，正、反向引物（0.2 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，重蒸水22.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪下观察结果。同时将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序所得菌株16S rDNA序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析。选取同源性最近的序列通过MEGA 5.0进行比对分析，并构建系统发育进化树。

1. 5 Biolog微生物自动鉴定

挑取单个纯化菌株接种于Biolog专用IF-A培养液中，配成一定浓度的菌悬液后用浊度计进行校准，使其浓度在标准要求范围内，然后倒入无菌的一次性V型加样槽中，使用Biolog专用移液排枪将菌悬液按每孔100 μL加到GenIII微孔板的96个孔内，标记后恒温（33 ℃）生化培養16～24 h，将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。

1. 6 动物感染试验

将菌株DS2015接种于LB液体培养基29 ℃培养12 h，取0.5 mL菌悬液用生理盐水稀释至1.0×108和1.0×109 CFU/mL。感染试验采用腹腔注射法，每个浓度梯度注射12尾七彩神仙鱼，每尾注射菌液0.1 mL，对照组注射0.1 mL无菌生理盐水。注射后的七彩神仙鱼养殖于自动充气水族箱中（100 cm×50 cm×40 cm），饲养水温（28.0±0.5）℃，养殖期间停止喂食，日换水量为50%，连续观察7 d并记录试验结果。

1. 7 统计分析

以Excel 2007和SPSS 18.0进行数据统计分析，并采用t 检验进行组间差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 病原菌的菌落形态特征及其培养特性

由图2可看出，病原菌在营养琼脂培养基上生长良好，其菌落呈圆形，表面光滑、边缘整齐、中央隆起，乳白色；菌落直径0.9～1.2 mm，生长丰盛。革兰氏染色呈阴性，单个菌体呈杆状、散在、两端钝圆。

2. 2 病原菌的生理生化特性

菌株DS2015的生理生化测定结果与摩氏摩根菌（M. morganii）的相似度达100%，初步确认该菌株为摩氏摩根菌，具体生理生化指标测试结果见表1。

2. 3 16S rDNA序列分析及系统进化树分析结果

菌株DS2015的16S rDNA序列为1208 bp，将其提交至GenBank，获得收录号KR866070；通过NCBI的BLAST比对分析，发现菌株DS2015的16S rDNA序列与GenBank中已公布摩氏摩根菌不同菌株16S rDNA 序列的相似性均在99%以上。从GenBank中选取10株摩氏摩根菌标准菌株的16S rDNA序列构建系统发育进化树，结果发现菌株DS2015与摩氏摩根菌聚为一簇（图3），Bootstrap检验值为99，可进一步确定菌株DS2015为摩氏摩根菌。

2. 4 Biolog微生物自动鉴定结果

恒温生化培养16～24 h后，其鉴定结果发现绿色ID 框显示“Species ID”，即菌株DS2015得到匹配好的结果（图4）。Biolog微生物自动鉴定结果表明，菌株DS2015最具可能性为摩氏摩根菌。

2. 5 动物感染试验结果

分别以1.0×108和1.0×109 CFU/mL的菌悬液感染七彩神仙鱼，人工感染4 h后七彩神仙鱼游动迟缓，12 h后出现死亡现象，48 h后七彩神仙鱼死亡率为42%～

63%。对照组的七彩神仙鱼无任何症状。人工感染发病七彩神仙鱼体表分泌大量黏液，以死亡七彩神仙鱼体表黏液为材料进行细菌分离，再经生物学特征鉴定，结果发现其特征特性与菌株DS2015完全相同，说明菌株DS2015是引起七彩神仙鱼发病的致病菌。

2. 6 药敏试验结果

选取20种抗生素对菌株DS2015进行药敏试验，结果发现其对庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等10种抗生素高度敏感，对米诺环素中度敏感，对青霉素G、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、红霉素、克林霉素、万古霉素和呋喃唑酮等9种抗生素已产生耐药性（表2）。

3 讨论

摩氏摩根菌是一种条件性致病菌，可感染多种养殖动物而致病， 引起感染动物肺脏淤血、脓肿，肾脏出血等内脏器官病变及体表皮肤、肌肉溃烂。近年来，因摩氏摩根菌引起的水产动物疾病日趋严重。目前已有研究从患病大鲵、锦鲤、草鱼、鲈鱼等水生生物体内分离鉴定出摩氏摩根菌，其发病症状主要表现为皮肤溃烂、肌肉充血、内脏器官病变（Holt et al.，1994；陆小萏等，2005；俞春红等，2012；李雪峰和王利，2015）。本研究从患病七彩神仙鱼体内分离获得摩氏摩根菌，病鱼临床表现出身体发黑、皮肤大量分泌黏液及鳍条溃烂等症状，与摩氏摩根菌引起其他鱼类的感染症状相似。

目前，水产养殖动物疾病仍是采用抗生素来控制其发生和流行，但化学药物防治极易导致病原菌产生耐药性（李瑞伟等，2014）。本研究的药敏试验结果表明，菌株DS2015对多数抗生素不敏感，可能与目前野生七彩神仙鱼在进口运输和暂养过程中常大量使用硝基呋喃类、四环素类和青霉素类抗生素以预防细菌性疾病的发生有关。七彩神仙鱼源摩氏摩根菌与其他水生生物源摩氏摩根菌的药敏结果存在明显差异。陆小萏等（2005）研究表明，锦鲤摩氏摩根菌对氧氟沙星等抗生素敏感，但对生产上的一些常规抗菌药物如青霉素类、庆大霉素、磺胺类等不敏感；孔蕾等（2013）对中华鳖摩氏摩根菌进行药敏试验，发现其对氨曲南、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感；韩娜娜等（2013）研究发现，锦鲤摩氏摩根菌对先锋霉素、万古霉素、青霉素等已产生耐药性，对头孢曲松、奥复星、复方新诺明等敏感；兰云等（2014）研究表明，从黄喉拟水龟分离获得的摩氏摩根菌对哌拉西林、头孢哌酮、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感；李瑞伟等（2014）研究表明，从患病大鲵分离获得的摩氏摩根菌对头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南等10种抗菌药物高度敏感，但对利福平、阿莫西林等表现出较高的耐药性；李雪峰和王利（2015）研究发现，从患病鲈鱼分离获得的摩氏摩根菌对磷霉素、菌必治等高度敏感，对痢特灵、红霉素和诺氟沙星中度敏感，对氨苄西林和氟苯尼考等11种抗菌药物不敏感（耐药）。这可能与不同患病品种的用药习惯有密切关系，长期或多次使用的药物较易产生耐药性，但具体原因有待进一步探究。

4 结论

摩氏摩根菌可引起七彩神仙鱼身体发黑、皮肤大量分泌黏液及鳍条溃烂等症状，严重者甚至引起死亡，生产中可选用庆大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星和复方新诺明等抗生素进行防治。

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（責任编辑 兰宗宝）