花叶良姜离体再生体系的建立

林茂 李进华 唐遒冥 龚建英 蒋济刚 钟程 王华新

摘要：【目的】建立花叶良姜高频高效离体再生体系，为其种苗周年规模化生产提供新方法。【方法】以花叶良姜种子为材料，开展无菌萌发、愈伤组织诱导、愈伤组织分化及生根培养研究。【结果】花叶良姜种子依次经75%乙醇处理60 s、0.1%升汞处理10 min、5%次氯酸钠处理3 min，污染率仅5.00%，萌发率为75.83%；适宜花叶良姜愈伤组织诱导的培养基为MS+1.50 mg/L 6-BA+0.30 mg/L 2，4-D，适宜花叶良姜愈伤组织分化的培养基为MS+2.00 mg/L TDZ+

0.10 mg/L 2，4-D，分化系数达10.03；花叶良姜组培苗最佳生根培养基为1/2MS+1.00 mg/L ABT1号生根粉，生根率为98.00%。【结论】通过愈伤组织途径可建立花叶良姜的离体再生体系。

关键词： 花叶良姜；愈伤组织；无菌萌发；再生体系

中图分类号： Q949.71 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1909-05

Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish high-efficiency and high-frequency in vitro regeneration system of Alpinia zerumbet Variegata，in order to provide a new method for annual large-scale production of A. zerumbet seedling. 【Method】Using A. zerumbet seeds as materials，the experiment on aseptic budding，callus induction，callus differentiation and rooting was carried out. 【Result】Results showed that， after A. zerumbet seeds were disinfected with 75% ethanol for 60 s，then 0.1% mercury chloride for 10 min，finally 5% sodium hypochlorite for 3 min，contamination rate was only 5.00%，and germination rate was 75.83%. Suitable medium for inducing callus was MS+1.50 mg/L 6-BA+0.30 mg/L 2，4-D，suitable medium for callus differentiation was MS+2.00 mg/L TDZ+0.10 mg/L 2，4-D，differentiation coefficient was up to 10.03. Furthermore，optimum medium for rooting was 1/2MS+1.00 mg/L ABT1 rooting powder，rooting rate was 98.00%.【Conclusion】In vitro regeneration system of A. zerumbet can be established by the way of callus culture.

Key words： Alpinia zerumbet Variegata； callus； aseptic budding； regeneration system

0 引言

【研究意义】花叶良姜（Alpinia zerumbet Variegata）为姜科山姜属多年生草本植物，别名花叶艳山姜、彩叶姜、斑纹月桃，原产于东亚，在我国福建、广东及台湾等地也有栽培（秦丽凤等，2013）。花叶良姜叶色艳丽，花姿优美，花香清纯，观赏价值极高，是园林绿化工程不可或缺的素材，在园林造景中的应用频率越来越高，市场需求越来越大。然而傳统的块茎分株繁殖存在增殖系数低、繁殖速度慢等问题（郝静韦，1996；曾宋君，2001；赵秀芳，2004；林瓞文，2006），无法满足市场需求。组培快繁技术具有繁殖速度快、系数高、后代整齐一致的优点，是种苗高效繁殖的有效途径之一。因此，建立花叶良姜高频高效离体再生体系，对花叶良姜高效繁殖具有重要意义。【前人研究进展】目前，对花叶良姜组织培养的研究不多。潘梅等（2012）以花叶艳山姜茎尖为外植体研究其离体快繁技术，结果表明，其芽诱导培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖培养基为2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍数达4.0倍，生根培养基为1/2MS+1.0～1.5 mg/L NAA，生根率为93.0%，移栽基质为河沙∶珍珠岩∶表土=1∶1∶1。黄赛等（2013）以花叶艳山姜种子为外植体，表面消毒以70%酒精预处理10 s，再用1.0 g/L升汞浸泡5 min，消毒效果佳；种子在MS培养基上即可萌芽；丛生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA培养基上增殖速度快，增殖倍数达4.3倍；芽苗在MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L AC培养基上生根率为94.5%；组培苗移栽在河沙∶腐质土∶椰糠（1∶1∶1）的混合基质中，成活率达92.0%。秦丽凤等（2013）以花叶良姜块茎为外植体建立了其组织培养体系，丛生芽增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增殖倍数达3.8倍，生根培养基为1/2MS+0.1～0.5 mg/L IBA+ 0.15% AC，生根率为100.0%。陈玉梅（2014）以花叶良姜根状茎为外植体，经初代培养、继代增殖和生根诱导，获得了花叶良姜的组培苗，增殖系数最高为7.03，有效苗率（苗生根率）为62.13%。【本研究切入点】已有对花叶良姜的研究主要利用根状茎和茎尖诱导丛生芽、以芽繁芽的方法进行繁殖，存在增殖系数较低等问题，而通过诱导愈伤组织和分化不定芽途径进行植株再生的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以花叶良姜种子为材料，经无菌萌发从而建立离体再生体系，为周年规模化生产花叶良姜种苗提供一种新的、高效的繁殖方法，也为其育种和遗传转化等基因工程研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试花叶良姜成熟种子由广西林业科学研究院提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 种子预处理及无菌萌发 将花叶良姜种子用800倍高锰酸钾溶液浸种20 min后清水冲洗10 min，再用浓硫酸预处理5 min，清水冲洗30 min，按表1的方案进行处理后，接种到MS培养基上，30 d后统计污染率和萌发率。每处理接种40粒种子，3次重复。

污染率（%）=污染种子数/接种种子数×100

发芽率（%）=萌发种子数/接种种子数×100

1. 2. 2 愈伤组织诱导 切取通过种子萌发得到无菌苗的叶片，切割成5 mm×5 mm小块，接种于愈伤诱导培养基（表2）上进行愈伤组织诱导，设Y1～Y9处理，每处理接种50小块，3次重复。30 d后统计愈伤诱导率。

愈伤诱导率（%）=产生愈伤数/接种叶片块数×100

1. 2. 3 愈伤组织分化 将愈伤组织切割成5 mm×5 mm小块，接种于分化培养基（表3）上，设F1～F9处理，每处理接种50块，3次重复。30 d后统计分化系数。

分化系数=分化芽数/接种愈伤组织块数

1. 2. 4 生根培养 当愈伤组织分化的不定芽高3～4 cm时，接种于生根培养基（表4）上进行生根培养，每处理接种量为50株，设S1～S10处理，每处理3次重复。30 d后统计生根率。

生根率（%）=生根数/接种不定芽数×100

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析，用Duncans法进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 花叶良姜种子的灭菌及无菌萌发

由表5可知，无菌萌发花叶良姜种子的污染率表现为处理5>处理1>处理4>处理2>处理6>处理3。其中，处理1的污染率与处理5差异不显著（P>0.05，下同），但二者与其他处理差异显著（P<0.05，下同），处理2、3、4、6相互间差异显著。说明花叶良姜种子的污染率随着升汞和次氯酸钠灭菌时间不同而发生改变，使用灭菌剂种类少、时间短，则污染率高，灭菌时间长则污染率低。从萌发率来看，处理3的萌发率最高，为75.83%，其次为处理6，为60.83%，随后是处理2，为22.50%，处理1、4和5的萌芽率较低。其中，处理3、6、2的萌芽率间差异显著，且均显著高于处理1、4和5，处理1、4和5间差异不显著。综上所述，处理3花叶良姜种子的污染率低，萌发率高，种子萌发生长好，子叶生长快（图1-A），灭菌效果最佳。因此，适宜花叶良姜种子灭菌的方法为：先用75%乙醇消毒60 s，然后用0.1%升汞消毒10 min，最后用5%次氯酸钠消毒3 min。

2. 2 花叶良姜种子的愈伤组织诱导

由表6可知，处理Y1、Y2和Y3的愈伤组织诱导率较低，相互间差异不显著；处理Y4、Y5和Y6的愈伤组织诱导率中等，其中，处理Y4与Y6差异不显著，处理Y5与Y6差异不显著，但三者均显著高于处理Y1、Y2和Y3；处理Y7、Y8和Y9的愈伤组织诱导率较高，三者间差异不显著，但均显著高于处理Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6，且愈伤组织为黄色，质地疏松（图1-B）。说明在MS中仅单独添加6-BA或NAA或2，4-D的培养基其愈伤诱导率较低，即单独使用一种激素不利于愈伤组织诱导，而将生长素与细胞分裂素配合使用时愈伤诱导率明显升高，其中，6-BA与2，4-D配合使用时愈伤诱导率显著高于6-BA与NAA配合使用。因此，适宜花叶良姜愈伤组织诱导的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2，4-D。

2. 3 花叶良姜种子的愈伤组织分化

由表7可知，处理F8的愈伤组织分化系数最大（10.03），且显著大于处理F1（4.71）、F4（6.38）和F7（8.94），说明含TDZ培养基比含6-BA培养基更有利于花叶良姜种子的愈伤组织分化，尤以2.00 mg/L TDZ對愈伤组织分化的效果更佳；在2，4-D浓度同为0.05 mg/L的情况下，处理F5的愈伤组织分化系数高于处理F6，但差异不显著；在2，4-D浓度同为0.10 mg/L的情况下，处理F7和F8植株长势好（图1-C），但处理F8的愈伤组织分化系数显著高于处理F7。因此，确定适宜花叶良姜愈伤组织分化的培养基为MS+2.00 mg/L TDZ+0.10 mg/L 2，4-D。

2. 4 花叶良姜种子分化苗的生根培养

由表8可知，处理S2的生根率显著高于处理S1，二者的生根数和根长差异虽不显著，但仍以处理S2略优于处理S1，说明不添加任何激素的1/2MS培养基比不添加任何激素的MS培养基更有利于花叶良姜分化苗生根。处理S3与S4、处理S5与S6、处理S7与S8、处理S9与S10的生根率差异不显著，说明在MS和1/2MS培养基中，不管是添加0.50或1.00 mg/L IBA还是添加0.50或1.00 mg/L ABT1号生根粉，激素浓度对花叶良姜分化苗生根率的影响均不明显。从表8还可看出，处理S7和S8的生根率和生根数分别显著高于处理S9和S10，说明花叶良姜分化苗生根率受激素种类的影响显著。综上所述知，在1/2MS+1.00 mg/L ABT1号生根粉培养基中，花叶良姜分化苗的生根率达98.00%，平均根数为4.23条，平均根长度为3.12 cm，小苗长势好（图1-D），因此，1/2MS+1.00 mg/L ABT1号生根粉可作为花叶良姜分化苗的最佳生根培养基。

3 讨论

离体形态发生的途径包括愈伤分化途径和不定芽途径，两个途径的区别在于是否经过愈伤组织阶段。目前，花叶良姜离体快繁体系的建立多数是通过不定芽途径来实现，通过愈伤组织途径建立的研究未见报道。本研究在花叶良姜种子无菌萌发后，以其叶片为外植体进行愈伤组织诱导和分化培养，建立了其高频高效的再生体系。其中，愈伤组织的诱导和分化受细胞分裂素和生长素影响明显，细胞分裂素以人工合成激素TDZ为主，其活性比6-BA更高，当浓度为2.00 mg/L时能促进不定芽分化，在低浓度范围（0.20～0.50 mg/L）则有利于不定芽增殖。

在生根培养中，生根效果受基本培养基种类和激素种类的影响较大，不添加任何激素的生根率低、根系少、根短，与赵秀芳（2004）对花叶艳山姜的研究结果不一致，可能是试验用植株的个体存在差异所造成，但也不排除赵秀芳（2004）研究中使用活性炭对生根的促进作用。本研究中以1/2MS为基本培养基的生根效果较MS优，与朱立明（2011）对非洲紫罗兰、王明莹等（2013）对蓝莓美登、饶宝蓉等（2014）对蓝莓夏普蓝、吕德任等（2015）对花叶艳山姜的研究结果一致，即MS含有高浓度的无机盐，能促进地上部优先生长，进一步加强顶端优势，1/2MS含有较低浓度的无机盐，则有利于地下部优先生长，从而促进生根。在传统的生根培养中，激素的使用多数以IBA、NAA等生长激素类为主，本研究将ABT1号生根粉应用于花叶良姜组织培养，取得了良好的生根效果，与李正平（1985）在月季组织培养中使用ABT生根粉的研究结果相似。

4 结论

本研究结果表明，通过愈伤组织诱导途径可以建立花叶良姜的离体再生体系。

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（责任编辑 思利华）