栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导技术初探

刘义存　黄天启

摘 要：通过对外界环境如温度、光照等条件对愈伤组织诱导的影响研究。结果：叶片培养在温度22℃时愈伤组织诱导的效果最好，可达到81.82%；有经过10 d黑暗培养处理的叶片，愈伤诱导率整体有明显提高；在最适温度和黑暗培养处理下，培养基配方为MS+BA 0.2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，栎叶枇杷叶片的愈伤诱导率达到100%。

关键词：栎叶枇杷；叶片；愈伤组织；诱导

中图分类号：S667.3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131005

枇杷属植物（EriobotryaLindl.），属蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae），分布于我国南部或东南亚地区的亚热带常绿树种，全世界枇杷属植物约有 30 个种或变种[1]，其中大部分都处于野生状态。野生枇杷蕴含丰富的遗传多样性，还具有一些可以用于栽培枇杷遗传改良的重要性状，如抗病虫、抗逆、抗倒伏等。野生枇杷与栽培枇杷不存在生殖隔离，容易通过常规育种或者生物技术手段将这些优良性状渐渗到栽培枇杷中去，使栽培枇杷不仅可获得优良性状，同时也拓宽遗传背景[2，3]。此外，野生枇杷还是优良砧木资源。关于枇杷胚、茎尖、胚乳、原生质体的离体培养均有不少研究，但关于叶片愈伤组织的研究，在栽培枇杷上尚有若干报道[4-7]，在野生枇杷上则鲜有报道。本文对栎叶枇杷的叶片诱导愈伤做了研究，旨在寻找最佳愈伤组织诱导的培养基配方以及培养条件，为下一步诱导胚、离体保存乃至形成新的植株提供一定的技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料选取

以栎叶枇杷（E.prinoidesRehd.andWils）组培苗的叶片为实验材料。

1.2 处理方法

取组培苗中成熟新鲜的叶片，在超菌工作台中切成大小约为0.5cm×0.5cm的小块，并迅速接种到相应的培养基中。接种时，叶片背向下，与培养基充分接触。整个过程控制在10～15 min一组。所有处理暗培养10d后，再转为全光照培养。

1.3 统计方式

本试验每个处理接种20块叶片，每处理重复2次；设置不同的实验组合，具体实验方案见文中的结果与分析。统计时间为接种后第30天；实验结果采用SAS11.0处理，部分数据采用Duncans新复极差法。

1.4 培养基配方

培养基主要成分：基本培养基为MS基本培养基，附加3%蔗糖、5g·L-1 的琼脂粉。

1.5 培养条件

培养湿度条件为：65%～70%；24 h全光照或全黑暗处理。

2 结果与分析

2.1 温度对栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导的影响

为了探究栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导的最适温度，我们以栎叶枇杷的叶片为材料，培养基配方为MS+KT 0.2+BA 0.2+NAA 0.5。设置3个不同温度，每个处理重复2次，每个重复接种20个材料。接种后，全黑暗处理10 d后，统计结果如表1。

在不同的温度处理下，栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导率有一定的差别。当处理温度为18℃和25℃时，叶片的愈伤组织诱导率都约为50%，没有什么差别；当处理温度为22℃时，叶片的愈伤组织诱导率达到81.82%。说明温度偏高或偏低都不利于栎叶枇杷叶片愈伤组织的诱导，只有22℃时，比较适合叶片愈伤组织的形成。

2.2 黑暗培养对栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导的影响

为研究经全黑暗培养和没有经黑暗培养的处理条件下对栎叶枇杷愈伤组织诱导的影响。设置2组实验，第1组为材料接种到培养基后，便在每天24h光照下培养30d；第2组为材料接种到培养基后，便每天24h全黑暗下培养10d，再转为每天全光照24h下，再连续培养20d。以上两组实验都设置如表2的6个不同的配方组合处理。培养温度为：22℃。结果如图2所示。

由图1可以看出，除了配方3没有诱导出愈伤组织外，其他培养基配方均诱导出叶片愈伤组织；有经黑暗培养10 d的第1实验组，除了配方3，其它配方的愈伤诱导率明显都高于另外一组没经黑暗阶段的第2组实验，在有经过黑暗处理的配方上，平均愈伤组织诱导率为57.8%，而实验组2的平均愈伤诱导率为40%；尤其黑暗处下的MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1配方，诱导率可以达到100%，启动也相对较快。与此同时，在配方MS+BA 1.0这一组处理中，原本在全光照下无法诱导愈伤组织生长的配方，而经黑暗处理后诱导出了愈伤组织，并取得了40%的诱导率。说明黑暗处理对于枇杷愈伤组织的诱导起到了很大的促进作用。

实验还发现，在黑暗培养实验组下的叶片，大部分的处理在接种4d后开始膨大，10d后从叶片边缘和叶脉处出现愈伤组织，30d 时已长出大量愈伤组织；而没有经黑暗培养实验组在同样的时间点确实没有特别明显的愈伤组织出现。

2.3 不同植物生长调节剂对栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导的影响

由图1可得，如单独使用 6-BA的愈伤组织诱导率为40%；单独使用KT处理的诱导率为50%；而单独使用2，4-D，不添加任何细胞分裂素，愈伤诱导率为只为0%。而在添加低浓度6-BA 0.2 mg·L-1和KT 0.2 mg·L-1的基础上改变2，4-D的浓度，所有处理都要比较单独使用一种植物生长调节剂的的愈伤诱导率要高。

在添加6-BA、KT与2，4-D不同浓度的组合中，发现随着2，4-D浓度的升高，愈伤诱导率出现明显的下降。当2，4-D浓度为1.0 mg·L-1时，愈伤诱导率为100%；当2，4-D浓度为3.0 mg·L-1时，愈伤诱导率降为96.67%；随着2，4-D浓度升高到6.0 mg·L-1时，愈伤诱导率已经降为60%。可见，2，4-D 对于栎叶枇杷叶片愈伤组织的诱导形成有重要的促进作用，但浓度不宜过高，也不适合单独使用。实验表明，栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导最适合的培养基配方为MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1。

3 结论

环境的培养因素对栎叶枇杷叶片愈伤组织的诱导有较大影响。在本文的3个温度设置试验中，数据显示在温度22℃时，是比较适合叶片愈伤组织的诱导。另外，单一使用某一种生长调节物质所得的效果并不如多种配合使用，尤其是2，4-D，单独使用几乎没有效果，但是配合BA，KT时则大大提高了栎叶枇杷叶片愈伤诱导率。通过对野生枇杷栎叶枇杷的叶片愈伤组织诱导实验，认为在培养温度22℃下，以MS+BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1作为最适培养基，材料接种后黑暗处理10 d，再转为全光照，是栎叶枇杷叶片愈伤组织诱导的最佳培养条件。通过本试验，对野生栎叶枇杷叶片愈伤组织有了一定的实验基础，从而为探索其它野生种枇杷属植物的叶片愈伤组织诱导研究提供一些理论依据和实验借鉴。

参考文献

[1]林顺权，杨向晖，刘成明，等. 中国枇杷属植物的自然地理分布[J]. 园艺学报，2004，31（5）： 101-104.

[2]刘义存，岑伟仪，黄天启， 等. 枇杷属植物茎尖离体培养及褐化抑制研究[J]. 果树学报， 2014（3）： 011.

[3]杨凤玲，林顺权. 枇杷叶片愈伤组织的诱导与保存[J]. 亚热带植物科学，2005（04）：1-5.

[4]陈红. 枇杷花药愈伤组织诱导的研究[D].四川农业大学，2003.

[5]彭晓军，王永清. 枇杷胚乳愈伤组织诱导和不定芽发生的研究[J]. 四川农业大学学报，2002（03）：228-231.

[6]林庆良，林顺权，陈振光. 栎叶枇杷原生质体的分离与培养[J]. 福建农业大学学报，1994（01）：26-29.

[7]Wai-Jane Ho，高峰. 枇杷愈伤组织培养物经体细胞胚胎发生再生出植株[J]. 福建果树，1989（01）：66-67.

作者简介：刘义存（1979-），男，助理研究員，博士，主要研究方向：园艺植物种质资源与生物技术；黄天启（1993-），男，在读研究生，主要研究方向：果树生物技术。