百蕊草愈伤组织离体培养条件的优化

吴峰+黄燕芬+曹永高+刘向阳+朱守引+任佳欣

摘 要：以百蕊草的幼嫩茎及叶片为外植体，探讨百蕊草外植体的最佳消毒时间、离体培养的培养基适宜配方、pH值以及培养温度。结果表明，最佳消毒时间为酒精消毒11 s后升汞消毒8 min；愈伤组织诱导增殖的最佳培养基为MS+1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D；最适pH值为5.8～6.0；最佳培养温度为22～26 ℃。

关键词：离体培养；愈伤组织；影响因素

中图分类号：Q945 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.004

Abstract： Taken the tender branches and Leaves of Thesium Chinese Turcz as explants， the best method for sterilization of explants，best medium and culture conditions for callus induction were instigated on callus by using the orthogonal experiments. The results showed that the best disinfection for alcohol after was 11 s and mercuric chloride disinfection was 8 min， the best medium for induction of callus was MS + 1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA +0.1 mg·L-1 2，4-D， the optimal pH was 5.8～6.0， and the best culture temperature was 22～26 ℃.

Key words： in vitro culture； callus； factors affecting

百蕊草（Thesium Chinense Turcz）为檀香科植物，别名百乳草、小草、地石榴等[1]， 始载于《图经本草》，味辛，微苦，性寒，归肺、脾、肾经。全草入药具有清热解毒，补肾涩精之功效，多用于治疗各种炎症，如急性乳腺炎、肺炎、咽炎、肺脓肿、淋巴结结核等疾病[2-4]。百蕊草为多年生寄生草本植物，根上有寄生根， 常附着在其他活体植物根上而生长[5-6]，所以，人工种植比较困难，到目前为止还没有进行规模化种植。通过组织培养的方法，在人工控制条件下快速繁殖愈伤组织，并建立百蕊草细胞悬浮培养系，生产次生代谢产物具有重要意义。

本研究的目的在于优化和完善百蕊草愈伤组织培养技术，为进一步通过细胞悬浮培养规模化生产百蕊草苷等次生代谢物提供稳定高产细胞系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为野生的百蕊草幼嫩茎和叶片，采自贵州省贵阳市花溪区。

1.2 试验方法

通过控制变量和正交试验的方法，用新鲜百蕊草植株经消毒处理后接种在愈伤组织诱导培养基上，培养观察一段时间后，分析对比并找出诱导百蕊草愈伤组织的培养基配方中细胞分裂素6-BA和生长激素NAA、2，4-D用量的最好配比；探究百蕊草外植体的最佳消毒时间、培养基pH值、培养温度；通过连续几周的观察，对比分析确定正交试验组中最有利于百蕊草愈伤组织分化培养的激素配比，再利用确定的最好配方进行百蕊草愈伤组织的扩大培养，以获得大量愈伤组织用于悬浮培养细胞系的建立。

1.2.1 百蕊草愈伤组织的诱导与初代培养 取新鲜幼嫩、健壮的外植体，用自来水冲洗干净后，用75%酒精浸泡10 s，无菌水清洗2次。再用0.1%的升汞溶液消毒5 min，无菌水浸洗3次，用无菌水浸泡10 min，用无菌水洗2次。最后将枝条和叶片剪成约1.0 cm长的小段，接种于1/2 MS+1 mg·L-1 6-BA+0.4 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D愈伤组织诱导培养基中。培养14 d百蕊草叶片渐渐分化变厚变粗，30 d后便形成绿色块状愈伤组织。

1.2.2 培养基及培养条件优化 选取植株上的幼嫩、健壮无病虫害的茎和叶作为外植体诱导愈伤组织。将初代诱导分化形成的愈伤组织切成0.5～0.8 cm2大小转接在培养基中，置于同一光照培养箱下培养观察记录，以筛选最好的诱导愈伤组织的培养基配方。

培养基配方筛选采用正交设计试验（表1），并控制pH值，光照培养箱温度、光照时间（10～12 h·d-1），光照强度（1 500～1 800 lx）一致。观察、对比分析，得到较为准确的培养愈伤组织的培养基配方，再用较好的培养基配方分别以pH值或温度为自变量，来确定培养百蕊草愈伤组织最佳的培养基pH值或光照培养箱温度。

1.2.3 外植体表面消毒时间对外植体消毒效果的影响 从植株上取具4～5片叶，长约6 cm的新生幼嫩枝条，用自来水清洗干净后置于超净工作台上，设置75%酒精浸泡消毒8，9，10，11，12 s，0.1%的升汞溶液灭菌8 min及75%酒精浸泡消毒11 s，0.1%的升汞溶液灭菌6，7，8，9，10 min。每次无菌水浸洗3次后浸泡5 min，然后将叶片切成2段、枝条剪成带有腋芽约1.0 cm长的小段，接种于表1的C2培养基中。

1.2.4 不同培养条件对愈伤组织生长的影响

（1）不同pH值对诱导愈伤组织生长的影响。按筛选出的C2配方MS+1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D配制培养基。设置pH值梯度为5.2，5.4，5.6，5.8，6.0。将长势较好的愈伤组织块切成0.5～0.8 cm2大小接入培养基中，相同培养条件下培养观察记录，以筛选百蕊草愈伤组织生长培养基的最佳pH值。