三种江蓠共附生细菌多样性及抑菌活性分析

覃媚 于清武 竺利波 李菲 颜栋美 余炼 高程海

摘要：【目的】研究廣西北部湾涠洲岛海域3种江蓠可培养共附生细菌多样性及其代谢产物的抑菌活性，为该海域海藻共附生细菌的开发利用及新型生物杀菌剂的研发提供参考依据。【方法】经稀释涂布法后观察分析3种江蓠共附生细菌的菌落形态及其分布，基于16S rRNA序列对江蓠共附生细菌的物种多样性进行分析，并利用纸片扩散法对其抑菌活性进行初步筛选。【结果】从广西北部湾涠洲岛海域的江蓠、扁江蓠和集团江蓠中共分离获得28株可培养的共附生菌株，隶属于4门13科15属（芽孢杆菌属、葡萄球菌属、弧菌属、冷杆菌属、交替单胞菌属、假交替单胞菌属、赤杆菌属、副球菌属、考克氏菌属、微球菌属、红小梨形菌属、Kytococcus sp.、Dermacoccus sp.、Maribacter sp.和Cobetia sp.）。有5株共附生菌株的代谢产物对番木瓜炭疽病原菌或荔枝炭疽病原病菌表现出较好的拮抗作用，其中，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径分别为15.0、14.5和15.5 mm），菌株GXS0023和GXS0031的代谢产物则对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径分别为15.0和17.0 mm）。【结论】广西北部湾海域的江蓠共附生细菌较丰富，其代谢产物活性各不相同，因此从海藻中寻找具有抗农业病原菌的微生物将成为研究抗农业病原菌杀菌剂的新方向。

关键词： 江蓠；16S rRNA；多样性；抑菌活性；广西北部湾

中图分类号： S968.434 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1966-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to explore the diversity of culturable epiphytic bacteria of three species of Gracilaria and bacteriostatic activities of their metabolits in sea area around Weizhoudao Island， Beibu Gulf， Guangxi， in order to provide reference for development of these epiphytic bacteria in the sea area and new biological fungicides. 【Method】Dilution coating method was applied to observe colonial morphology and distribution of epiphytic bacteria of three species of Gracilaria. Diversity of the epiphytic bacteria of Gracilaria was analyzed based on 16S rRNA sequence and their bacteriostatic activities were screened by disc diffusion method. 【Result】Twenty-eight strains were extracted from Gracilaria verrucosa， Gracilaria textorii and Gracilaria glomerata in Beibu Gulf， Guangxi belonged to four subclasses， thirteen families and fifteen genuses（Bacillus sp.； Staphylococcus sp.； Vibrio sp.； Psychrobacter sp.； Alteromonas sp.；Pseudoalteromonas sp.； Erythrobacter sp.； Paracoccus sp.； Kocuria sp.； Micrococcus sp.； Rhodopirellula sp.； Kytococcus sp.； Dermacoccus sp.； Maribacter sp.； Cobetia sp.）. The metabolites of five strains showed obvious antagonistic effects against Colletrichum gloeosporiode M2 or C. gloeosporiodes Lz2. Metabolites of strains GXS0044， GXS0017 and GXS0035 showed sound inhibition effects towards C. gloeosporiodes Lz2（antibacterial circle diameters were 15.0， 14.5 and 15.5 mm， respectively）. Metabolites of strains GXS0023 and GXS0031 showed obvious inhibition effects towards C. gloeosporiode M2（antibacterial circle diameters were 15.0 and 17.0 mm， respectively）. 【Conclusion】There are resourceful epiphytic bacteria of Gracilaria and their metabolites activities are different. Therefore， searching for pathogens that are resistant to agricultural diseases from seaweeds will become a new direction in development of new pathogen fungicides that against agricultural diseases.

Key words： Gracilaria； 16S rRNA； diversity； bacteriostatic activity； Beibu Gulf in Guangxi

0 引言

【研究意义】番木瓜和荔枝均属热带亚热带水果，其食味鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，但二者又属于呼吸跃变型果实，采后不耐贮藏、运输，其中番木瓜炭疽病菌（Colletrichum gloeosporiode M2）和荔枝炭疽病菌（C. gloeosporiodes Lz2）是引起番木瓜和荔枝采后腐烂的主要病原菌（张传飞和戚佩坤，1994；刘爱媛等，2003）。目前，主要使用百菌清、嘧菌酯等化学杀菌剂对番木瓜炭疽病原菌和荔枝炭疽病原菌进行防治（彭埃天等，2011），但易造成水果污染和农药残留，影响消费者健康。因此，研发低毒、高效、环境友好型的生物杀菌剂迫在眉睫。【前人研究进展】藻类在生长过程中会向周边环境释放大量的有机物质，使藻细胞周围形成一个独特的微环境，称为藻际微环境。藻际微环境中存在大量细菌，这些细菌具有独特的结构与功能，与藻细胞共同构成复杂的生态关系（李云冰等，2011）。已有研究表明，藻际微环境中的细菌会影响藻体的附着与变态（张朝霞等，2005），同时影响藻体分泌物质的生成（Hirmas，2008），其中许多海洋活性物质都是由海藻共附生菌分泌产生（Jensen and Fenical，1994；缪辉南和戴建凉，1995）。Manuel等（1985）从5种绿藻和棕藻中分离出224株菌种，经抗生素测试，结果显示有38株具有抗生素活性。马悦欣等（2003）报道，海藻的某些共附生菌对虾源荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和费氏弧菌（Vibrio fischei）均具有良好的抑制作用。卜蒙蒙（2015）从海藻样品表面分离获得153株菌株，并利用琼脂块法对其进行抑菌活性检测，结果发现其中有3株菌株对金色葡萄球菌有良好的抑制作用，有1株菌株对大肠杆菌有较好的抑制作用。因此，有望从海藻共附生细菌中分离筛选出具有抗番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌活性的海洋细菌，进而研发出基于海洋细菌的生物杀菌剂，以促进我国水果行业的健康发展。【本研究切入点】广西北部湾海域地处亚热带，是大型经济藻类江蓠的主产區，但至今有关广西北部湾海域海藻共附生细菌方面的研究报道较少，而针对抗番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌的海洋细菌研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对广西北部湾涠洲岛海域的江蓠（Gracilaria verrucosa）、扁江蓠（G. textorii）和集团江蓠（G. glomerata）3种海藻可培养的共附生细菌进行多样性分析，并对其代谢产物的抑菌活性进行初步筛选，以期为广西北部湾海域海藻共附生细菌的开发利用及新型生物杀菌剂的研发提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

3种江蓠样品均采自广西北海涠洲岛石螺口海域（东经109°5′～109°13′，北纬20°54′～21°5′），番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌购自北京北纳创联生物技术研究院，Marine agar 2216、Trehalose-Aspartic Acid（M4）、改良Gause No.1（M6）和ISP2等培养基购自南宁蓝天实验设备有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株分离纯化 取3种江蓠样品各约2.0 g，无菌水冲洗表面3次后于植物匀浆器中研磨，将研磨好的样品转移至250 mL锥形瓶中，加入80 mL无菌海水，置入28 ℃恒温培养箱中振荡（140 r/min）培养48 h，然后分别取3种混合液制备成10-5～10-1不同梯度的稀释液，吸取各梯度稀释液200 μL涂布于4种培养基上，3次重复，28 ℃下培养5～7 d后进行菌株计数和分离纯化。分离纯化的菌株用已灭菌牛奶管保藏于-80 ℃超低温冰箱，或制成20%（w/v）甘油管保藏于-80 ℃超低温冰箱。

1. 2. 2 PCR扩增和系统发育进化树构建 菌株DNA提取和16S rRNA序列扩增均参照滕松山（2010）的方法，采用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT

CA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR扩增程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将阳性扩增产物送至北京华大基因研究中心测序。将测序结果在GenBank中进行BLAST同源性搜索及ClustalX多重比对，并采用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，各分支的置信区间值均进行Boostrap 1000次检测。

1. 2. 3 菌株发酵及次级代谢产物提取 菌种培养基和发酵培养基均采用ISP2液体培养基。取适量菌种接种至装有80 mL液体培养基的250 mL三角瓶中作为菌种培养液，并置于28 ℃恒温培养箱中振荡（140 r/min）培养7 d，然后将每株菌株的菌种培养液分别接入经121 ℃灭菌且装有160 mL液体培养基的500 mL三角瓶中再培养7 d，每株菌株5个重复。发酵得到的菌株培养液用细胞破碎仪进行破碎、乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪浓缩，得到的浸膏即为次级代谢产物供试样品。

1. 2. 4 抗菌活性试验 用二甲基亚砜（DMSO）溶液分别将分离鉴定的各菌株次级代谢产物供试样品溶解，配制成5 mg/mL的溶液，取5.0 μL滴加到直径6 mm的滤纸片上，然后将滤纸片分别置于已接入荔枝炭疽病菌和番木瓜炭疽病菌的培养基上。以5 mg/mL百菌清为阳性对照，DMSO溶液为空白对照。经37 ℃培养48 h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径，每个样品3次重复。

2 结果与分析

2. 1 菌株分离鉴定结果

从采集的江蓠、扁江蓠和集团江蓠样品中共分离获得34株共附生菌株，经PCR扩增各菌株16S rRNA序列、测序及采用BLAST进行同源性比对，结果发现34株菌株中包含6株重复菌株。28株不同的共附生细菌分属于4门13科15属（芽孢杆菌属、葡萄球菌属、弧菌属、冷杆菌属、交替单胞菌属、假交替单胞菌属、赤杆菌属、副球菌属、考克氏菌属、微球菌属、红小梨形菌属、Kytococcus sp.、Dermacoccus sp.、Maribacter sp.和Cobetia sp.）。其中，从江蓠中分离获得10株共附生细菌，从扁江蓠中分离获得14株共附生细菌，从集团江蓠中分离获得10株共附生细菌（表1）。由表1可知，江蓠、扁江蓠和集团江蓠两两之间存在相同的共附生细菌，江蓠与扁江蓠存在1株相同的共附生细菌Psychrobacter celer（GXS0038），江蓠与集团江蓠存在2株相同的共附生细菌Staphylococcus warneri（GXS0045）和Maribacter dokdonensis（GXS0017），扁江蓠与集团江蓠存在3株相同的共附生细菌Alteromonas australica（GXS0022）、A. macleodii（GXS0024）和Cobetia marina（GXS0016）。

同时，在属级水平上对3种江蓠共附生细菌进行Venny分析，结果如图1所示。江蓠与扁江蓠存在1个共有菌属（Psychrobacter sp.），江蓠与集团江蓠存在2个共有菌属（Staphylococcus sp.和Maribacter sp.），扁江蓠与集团江蓠存在2个共有菌属（Alteromonasspgttg sp.和Cobetia sp.）。3种江蓠存在相同的种或属，是由于3种江蓠同属于红藻门（Rhodophyta）江蓠科（Gracila-

riaceae）江蓠属（Gracilaria），其生理生化特性存在一些相似性，而且这些样品采自同一海域，故其共附生菌具有相似性。从图1还可看出，从江蓠中共分离获得6个属，扁江蓠中共分离获得9个属，集团江蓠中共分离获得5个属，即扁江蓠较江蓠和集团江蓠藻际微环境复杂，可培养的共附生细菌多样性相对较丰富。

2. 2 菌株系統发育进化分析结果

基于16S rRNA序列对所分离获得的菌株进行系统发育进行分析，结果表明，从江蓠、扁江蓠和集团江蓠中分离获得的28株菌株分布在四大类群，分别为α-变形菌纲、γ-变形菌纲、放线菌门和厚壁菌门。从江蓠共附生细菌系统发育进化树（图2）可看出，菌株GXS0044、GXS0023和GXS0031的亲缘关系较近，均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；菌株GXS0026、GXS0045和GXS0046的亲缘关系较近，均属于葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）。从扁江蓠共附生细菌系统发育进化树（图3）可看出，菌株GXS0022、GXS0042、GXS0028和GXS0024的亲缘关系较近，均属于交替单胞菌属（Alteromonas sp.），且菌株GXS0022和GXS0042的关系更近。从集团江蓠共附生细菌系统发育进化树（图4）可看出，菌株GXS0009、GXS0051和GXS0045的亲缘关系较近，均属于葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）；菌株GXS0037和GXS0052的亲缘关系较近，均属于赤杆菌属（Erythrobacter sp.）；菌株GXS0016和GXS0025的亲缘关系较近，均属于Cobetia sp.。

2. 3 共附生菌活性的初步筛选结果

将从江蓠、扁江蓠和集团江蓠分离获得的28株菌株分别用番木瓜炭疽病菌、荔枝炭疽病菌进行初步的活性筛选试验，结果发现有5株共附生菌株的代谢产物对番木瓜炭疽病菌或荔枝炭疽病菌表现出较强的拮抗作用（表2）。其中，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径分别为15.0、14.5和15.5 mm），菌株GXS0023和GXS0031的代谢产物则对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径分别为15.0和17.0 mm）。

3 讨论

目前，国内外有关海藻的研究偏重于其营养价值（叶静等，2010）、加工工艺（吴湛霞等，2010）及化学成分分析（夏欢等，2015），针对其共附生细菌的研究报道较少。但已有大量研究表明，许多海洋活性物质都是由海藻共附生菌分泌产生，海藻共附生菌是个潜在的资源库（Jensen and Fenical，1994；Burgess et al.，1999；孙杰等，2007；赵婷婷等，2009；杨瑞云等，2010）。海藻与其共附生细菌间存在物质交流（Manuel et al.，1985；Bansemir et al.，2006），海藻的分泌物与共附生细菌多样性密切相关，使其演变出独特的种类或产生特殊的代谢活性物质，进而维护、改善和调节整个水域的生态系统平衡。同样，这些共附生细菌又会影响海藻生长和分泌。赵锐等（2013）研究发现，某些海藻共附生细菌会通过吸收藻类的营养物质，经过代谢后以矿物质或其他形式回馈藻体或释放入海水环境中，或是产生影响海藻叶片正常生长发育的代谢物质。本研究对广西北部湾涠洲岛石螺口海域的3种江蓠共附生细菌进行分离鉴定，分离获得的菌株隶属于4门13科15属，表明江蓠中确实存在较丰富的共附生细菌。通过对比江蓠、扁江蓠和集团江蓠的共附生细菌，发现不同种类江蓠间存在一些相同的细菌，是由于3种江蓠同属于红藻门（Rhodophyta）江蓠科（Gracilariaceae）江蓠属（Gracilaria），其生理生化特性存在一些相似性，而且这些样品采自同一海域，故其共附生细菌具有相似性。

本研究结果还表明，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用，菌株GXS0023和GXS0031的代谢产物则对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用。其中，菌株GXS0044、GXS0023和GXS0031均为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。已有研究证实，芽孢杆菌种群中包含许多具有特殊功能的菌株，如具有抑制多种植物病原菌的能力（刘国红等，2008；陈蕾等，2011；毛涛等，2014），本研究结论进一步佐证了这一观点。芽孢杆菌属是广泛存在于自然界中的一类细菌，无致病性，对人畜及生态环境均不存在危害性。截至2014年12月，我国已有5种生防芽孢杆菌类生物杀菌剂完成农药登记，共有59个产品（唐容容等，2013；张荣胜等，2014）。由于生防芽孢杆菌生物杀菌剂对人畜安全，无农药残留和抗药风险，对环境友好，是农药未来的发展方向。朱鹏等（2010）研究报道，微小卡罗藻的共附生微生物W-4（Maribacter dokdonensis）对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酿酒酵母和铜绿假单孢菌均有不同程度的抑制作用；刘阳等（2013）研究发现，从东山湾软珊瑚共附生菌中分离获得的Maribacter dokdonensis IA07679可产蛋白酶和酯酶；Gao等（2014）研究发现，Kytococcus sedentarius具有抑制藤壶幼虫的活性。因此，下一步将对抗菌活性较好的菌株培养条件进行优化，并研究其抑制农业病原菌的机理，以期为新型抗农业病原菌杀菌剂的研发提供参考依据，进而拓宽生防芽孢杆菌类杀菌剂的应用范围。

4 结论

广西北部湾海域的江蓠共附生细菌较丰富，其代谢产物活性各不相同，因此从海藻中寻找具有抗农业病原菌的微生物将成为研究抗农业病原菌杀菌剂的新方向。

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（責任编辑 兰宗宝）