PTD—FNK蛋白的原核表达及纯化鉴定

王晓晔 石博妹 王英群 刘德玉 李铭 李芳芳 李珣 胡传活

摘要：【目的】原核表达Bcl-xL蛋白的突变体PTD-FNK蛋白，为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物，以pET-28a（+）-

PTD-Bcl-xL质粒为模板，PCR扩增两段突变序列；回收PCR产物片段进行Dpn I消化，構建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α，以IPTG诱导融合蛋白表达，探索IPTG诱导表达的适宜温度，最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp，经Dpn I消化后进行重组反应，再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建pET-28a（+）-PTD-FNK质粒。在30 ℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白，以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白，且诱导时间短，无须复性，有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。

关键词： PTD-FNK蛋白；点突变；原核表达；纯化鉴定

中图分类号： TQ936.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1019-06

0 引言

【研究意义】PTD-FNK蛋白是人工构建的抗凋亡蛋白。目前，PTD-FNK蛋白主要通过复性PTD-FNK蛋白的包涵体获得（Asoh et al.，2002），但由于包涵体蛋白复性耗时长、产率低（张颋等，2009），而影响 PTD-FNK蛋白功能的研究与应用。因此，如何有效纯化获得大量可溶性PTD-FNK蛋白，对深入研究PTD- FNK蛋白生理功能及加快其在家畜精液保存中的应用进程具有重要意义。【前人研究进展】Bcl-xL蛋白最早是从禽类的互补DNA（cDNA）文库中筛选获得，是Bcl-2蛋白家族抗凋亡亚家族的重要成员，发挥抗凋亡作用。Bcl-x基因通过选择性剪接产生两个剪接变体，长mRNA编码的Bcl-xL蛋白具有抗凋亡作用，而短mRNA编码的Bcl-xS具有促凋亡作用（Boise et al.，1993）。Bcl-xL蛋白是Bcl-2蛋白家族中第一个被阐明空间结构的成员，Muchmore等（1996）利用X射线晶体衍射与核磁共振分光术相结合的方法分析Bcl-xL蛋白的结构，确认其分子结构中包含8个α螺旋，其中α5螺旋和α6螺旋结构在调控Bcl-2家族蛋白的抗凋亡功能中发挥重要作用。FNK蛋白是一个人工构建的细胞保护蛋白，来源于大鼠Bcl-xL蛋白。Asoh等（2000）研究发现，通过突变大鼠Bcl-xL蛋白的3个氨基酸（22Y→F、26Q→N和156R→K），构建了超级抗凋亡因子FNK（最初命名为bcl-xFNK），成为哺乳类动物凋亡因子中首个也是唯一的功能增强型突变体，且过表达FNK蛋白的细胞抵抗氧化应激、热应激、多种类型凋亡诱导剂等不利因素的能力显著增强。PTD是蛋白转导结构域，由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，自身具有跨膜活性，能将与其通过化学交联或基因工程连接外源物质包括大分子、药物等带入细胞（Brooks et al.，2005；Gullotti et al.，2013），甚至能透过血脑屏障和眼睛障碍，并保持外源物质的活性（Rapoort and Lorberboum-Galski，2009；Wang et al.，2010；Zhang et al.，2012；Batool et al.，2013）。因此，将PTD蛋白与FNK蛋白融合获得的PTD-FNK蛋白，能快速进入细胞，保护各种异常刺激引起的细胞凋亡与坏死，尤其在猪精液冷冻稀释液中添加300 nmol/L PTD- FNK蛋白能显著提高冷冻猪精子活力、线粒体完整性及存活时间（Shimokawa et al.，2012）。【本研究切入点】目前，国外关于PTD-FNK蛋白的获取主要是通过大肠杆菌原核表达，表达形式为包涵体，但包涵体必须经过复性后才能发挥其功能；国内尚无有关PTD- FNK蛋白的研究报道。【拟解决的关键问题】通过点突变技术构建PTD-FNK蛋白的原核表达载体，并优化诱导表达条件使其呈可溶性表达，以期为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21（DE3）、pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL质粒由广西大学动物科学技术学院解剖实验室保存提供。2×Taq Plus Master Mix、DNA Marker、T4连接酶、点突变试剂盒、His标签抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG等购自南京诺唯赞生物科技有限公司，限制性内切酶Sal I和EcoR I、蛋白Marker购自Thermo公司；TMB显色购自生工生物工程（上海）股份有限公司，卡那霉素、IPTG（异丙基-

β-D-硫代半乳糖苷）、咪唑购自北京索莱宝科技有限公司，Gel Extration Kit和Plasimid Mini Kit购自Biomiga公司，NI-NTA购自QIAGEN公司。

1. 2 引物设计与合成

根据FNK蛋白氨基酸序列（表1）及Mut Express II不连续双碱基定点突变试剂盒说明，设计突变Bcl-xL基因碱基扩增引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 突变序列PCR扩增

以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL质粒为模板、P1/P4为引物，对P1P4突变序列进行PCR扩增。扩增程序： 95 ℃预变性30 s；95 ℃ 8 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，进行30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对目的产物进行纯化回收。同时，以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL质粒为模板、P2/P3为引物，对P2P3突变序列进行PCR扩增。

1. 4 PTD-FNK蛋白原核表达质粒构建

将纯化回收的P1P4片段（35.0 μL）和P2P3片段（35.0 μL）加入0.8 μL Dpn I进行消化（37 ℃，2 h）。P1P4片段和P2P3片段进行重组反应，重组反应体系：5×CE II Buffer 4.0 μL，P1P4片段Dpn I消化产物10.0 μL，P2P3片段Dpn I消化产物4.0 μL，ExnaseTM II 2.0 μL，混匀，37 ℃反应30 min后立即冰浴5 min。以20.0 μL反应产物转化至大肠杆菌DH5α，然后将菌液涂布于含50 mg/mL卡那霉素的LB培养基上，挑取菌落进行酶切鉴定及测序，突变后质粒命名为pET-28a（+）-

PTD-FNK质粒。

1. 5 pET-28a（+）-PTD-FNK质粒在大肠杆菌BL21中诱导表达

挑取pET-28a（+）-PTD-FNK质粒的新鲜菌落，接种至含50 mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养过夜，按1∶100比例接种于4支含50 mg/mL卡那霉素的LB液体培养基（3 mL）中，37 ℃下振荡（220 r/min）培养至OD600为0.4～0.6（约3 h）。取其中一支作阴性对照，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，分别经20 ℃诱导过夜、37 ℃诱导4 h和30 ℃诱导7 h后，4000 r/min离心10 min，收集菌体（弃上清液），用500.0 μL的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）悬浮，超声波破碎6 min，再4000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀，沉淀用500.0 μL的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）悬浮，同时设立空的BL21菌株为空白对照，进行SDS-PAGE电泳。

1. 6 融合蛋白纯化

将阳性菌按1∶50比例接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基（1 L）中，37 ℃振荡培养至OD600为0.4～0.6，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导7 h，离心收集菌体。收集的菌体用Buffer溶解后在冰浴中超声波破碎菌体，4 ℃下12000 r/min离心20 min，收集上清液进行纯化。纯化步骤：取5 mL Ni-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer（20 mmol/L咪唑）清洗平衡柱，流速5 mL/min；将收集的裂解上清液上柱，流速2 mL/min，收集过柱液；以60倍柱床体积的Binding Buffer（20 mmol/L咪唑）清洗平衡柱，流速5 mL/min；用Wash Buffer（50、100、150 mmol/L咪唑）洗杂，流速2 mL/min，收集洗脱液；再以Elution Buffe（500 mmol/L咪唑）洗2次，流速2 mL/min，收集洗脱液。将收集到的组分进行SDS-PAGE电泳以检测纯化效果，0.45 μm滤膜过滤浓缩分装，-80 ℃保存备用。

1. 7 Western bloting检测纯化产物

制备12%的SDS-PAGE电泳胶，取纯度高的融合蛋白上样（10.0 μL），具体步骤：浓缩胶80 V 20 min，分离胶120 V 60 min；将蛋白250 mA湿转90 min至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉缓慢振荡封闭2 h，洗膜；加入His标签抗体（一抗），1∶5000稀释，37 ℃下缓慢振荡2 h，洗膜；加入辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（二抗），1∶10000稀释，37 ℃下缓慢振荡40 min，洗膜；DAB显色，在天能凝胶成像系统下观察拍照。

2 结果与分析

2. 1 PTD-FNK蛋白原核表达载体的构建

以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL质粒为模板、P1/P4为引物进行P1P4突变序列PCR扩增，扩增产物大小462 bp，与预期结果一致（图1）。相同方法，以pET-28a（+）-

PTD-Bcl-xL质粒为模板、P2/P3为引物进行P2P3突变片段扩增，扩增产物大小5616 bp，与预期结果相符（图2）。P1P4片段和P2P3片段经Dpn I消化后进行重组反应，转化至大肠杆菌DH5α并提取重组质粒，重组质粒经EcoR I和Sal I酶切后以1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，重组质粒大小744 bp，与预期结果一致（图3）。将阳性质粒进行基因测序，测序结果（图4）在NCBI进行比对，结果证实已成功构建PTD-FNK蛋白的原核表达质粒pET-28a（+）-PTD-FNK。

2. 2 pET-28a（+）-PTD-FNK质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达

将pET-28a（+）-PTD-FNK质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3），分别在20 ℃诱导过夜、30 ℃诱导7 h和37 ℃诱导4 h等条件下进行IPTG诱导。SDS-PAGE电泳结果（图5）显示，与未诱导的BL21全菌液相比，IPTG诱导后的上清液和沉淀中均出现特异性条带（36 kD）。其中，37 ℃诱导4 h的融合蛋白主要以包涵体形式进行表达，上清液中融合蛋白表达量较少；在20 ℃下进行诱导，其上清液中的融合蛋白表达量比37 ℃下诱导的量增多；在30 ℃下诱导的上清液融合蛋白表达量与20 ℃下诱导的差异不明显，但诱导时间短，且有利于蛋白纯化，因此确定IPTG诱導条件为30 ℃诱导7 h。

2. 3 PTD-FNK蛋白的纯化

经NI-NTA Argrose纯化发现，与裂解上清液相比，高浓度（500 mmol/L）咪唑洗脱组分里只含有单一的蛋白条带（图6），即纯化得到纯度较高的融合蛋白（36 kD）。

2. 4 纯化融合蛋白的Western bloting检测

Western bloting检测结果显示，纯化融合蛋白在36 kD处出现特异性条带（图7），说明纯化所得融合蛋白即为PTD-FNK蛋白。

3 討论

Bcl-xL蛋白是Bcl-2蛋白家族中的一员，在机体中发挥抗凋亡作用。Bcl-xL蛋白结构中的8个α螺旋与其功能密切相关，因此通过改变稳固α螺旋结构可获得对应的突变体。本研究以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL质粒为模板，通过定点突变Bcl-xL蛋白的3个氨基酸，分别是22Tyr→Phe、26Gln→Asn和165Arg→Lys。为了将FNK蛋白导入细胞和组织内部，须先将PTD与FNK融合在一起，制备PTD-FNK融合蛋白。PTD-FNK蛋白已被证实具有跨膜活性，添加在细胞培养基中能快速进入人工培养细胞或软骨细胞内（Asoh et al.，2002，2005； Ozaki et al.，2004）。PTD-FNK蛋白的功能研究还发现，其能保护各种病理条件刺激下的细胞死亡、病理模型中的脑缺血性损伤（Katsura et al.，2008）、心缺血性损伤（Arakawa et al.，2007）、肝缺血性损伤（Ozaki et al.，2004）、四氯化碳诱导的肝损伤（Asoh et al.，2005）、脂多糖引起的急性肺损伤（Chen et al.，2007）、氨基糖苷类耳中毒（Kashio et al.，2007）、化疗引起的秃头症（Kashio et al.，2007）及骨髓移植中的细胞死亡（Tara et al.，2007），且具有冷冻保护剂的作用，能有效抑制冷冻解冻引起的软骨细胞死亡（Sudo et al.，2005），提高冷冻解冻后猪精液的品质（Shimokawa et al.，2012）。

至今，国内尚无有关人工构建PTD-FNK蛋白的研究报道。本研究将构建的pET-28a（+）-PTD-FNK质粒转化至大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达，发现在诱导温度为37 ℃时，融合蛋白主要以包涵体形式进行表达。刘爽和胡保成（2005）研究表明，降低大肠杆菌的培养温度能够降低蛋白合成速度，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体形成。本研究结果也表明，经20 ℃诱导过夜，其上清液中可溶性表达蛋白量比37 ℃下诱导4 h的量增多，进一步佐证降低温度能抑制包涵体形成。由于20 ℃诱导过夜耗时长，本研究同时进行30 ℃诱导7 h的探讨，结果发现30 ℃下诱导的可溶性蛋白表达量明显高于37 ℃下的诱导量，与20 ℃下诱导的差异不明显，但诱导时间短，且有利于蛋白纯化，因此确定IPTG诱导条件为30 ℃诱导7 h。

本研究采用NI-NTA Argrose纯化目的蛋白，是利用咪唑可与组氨酸竞争性结合镍离子的原理，即低浓度咪唑洗脱杂蛋白，高浓度咪唑洗脱目的蛋白。纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。已有研究表明，PTD-FNK蛋白是以包涵体形式进行表达（Asoh et al.，2002，2005；Chen et al.，2007），但包涵体中的多肽链折叠错误，无活性，必须通过复杂的变性复性过程才能获得具有功能活性的蛋白（刘爽和胡保成，2005），且产量很低。本研究成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白，对今后加强其功能研究有重要意义。

4 结论

本研究结果表明，通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白，且诱导时间短，无须复性，有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。

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（責任编辑 温国泉）