碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼血清pH、游离氨浓度及相关基因表达的影响

赵岩 吴俊伟 孟森 王燕 吴昊 赵金良

摘要：【目的】了解碳酸盐碱度对罗非鱼的毒性及其相應耐受机制，为耐盐碱罗非鱼育种及生产应用提供理论指导。【方法】将尼罗罗非鱼从淡水直接转入4个碳酸盐碱度处理（4.0、6.0、8.0和10.0 g/L NaHCO3）中进行急性胁迫试验，利用pH计、紫外分光光度计及荧光定量PCR，分别检测胁迫0.5、1.0、4.0、6.0、9.0、12.0、18.0、24.0、36.0和48.0 h的罗非鱼血清pH、游离氨浓度及肾组织中碳酸酐酶（CA）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因的相对表达量。【结果】在各碳酸盐碱度处理组中，胁迫1.0 h后罗非鱼的血清pH、游离氨浓度均发生显著变化（P<0.05）。经4.0和6.0 g/L碳酸盐碱度胁迫48.0 h后未出现死鱼现象，其血清pH、游离氨浓度及CA基因、GS基因的表达量均呈先升高再降低的变化趋势；经8.0 g/L碳酸盐碱度胁迫9.0 h后陆续出现死鱼现象，血清pH高达8.11、游离氨浓度为486.28 μmol/L，至胁迫12.0 h后罗非鱼全部死亡；经10.0 g/L碳酸盐碱度胁迫出现死鱼的时间明显早于8.0 g/L碳酸盐碱度胁迫，胁迫1.0 h后其血清pH达8.14、游离氨浓度为365.89 μmol/L，胁迫4.0 h后罗非鱼全部死亡。【结论】尼罗罗非鱼能耐受的血清pH上限在8.10附近，耐受的游离氨浓度为525.66 μmol/L。在低碳酸盐碱度（小于6.0 g/L）胁迫下，尼罗罗非鱼可通过生理调控血清pH和游离氨浓度而适应胁迫逆境，且CA和GS参与了相应离子的转运及氨氮代谢。

关键词： 尼罗罗非鱼；碳酸盐碱度；血清pH；游离氨；CA基因；GS基因

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1032-07

0 引言

【研究意义】我国约有3067万ha盐碱水域，但由于碳酸盐碱度和pH较高，大多数盐碱水域水体中的生物资源较贫瘠，基本处于闲置状态（么宗利等，2010）。近年来，上海海洋大学以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为对象，用氯化钠、碳酸盐等自制盐碱性水体开展耐盐碱罗非鱼新品种选育工作（赵丽慧等，2013），同时开展鱼类盐碱胁迫应答及高盐碱耐受机制研究（赵丽慧等，2014b），以期选育出适合盐碱水域的养殖品种，有效利用盐碱水资源发展生态农业，这对破解某些地区长期制约渔业发展的难题，实现当地生产与生态相互协调、渔业转型升级具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关碳酸盐碱度对鱼类毒性及相应耐受性的研究较多，包括碳酸盐碱度胁迫后鲤、鲢、鳙、草鱼、尼罗罗非鱼（雷衍之等，1985）、彭泽鲫（郑伟刚等，2004）、青鳉（Yao et al.，2010）、大鳞鲃（徐伟等，2011）和达里湖鲫（周伟江等，2013）的存活能力均有报道，发现多数鱼类在碳酸盐碱胁迫后会出现异常的行为及形态特征，如急游冲撞、迅速翻白上浮、体表分泌大量黏液、鳃部出血、快速死亡，死亡鱼的头部发黑、体表泛青色、鳃片暗红或紫褐色，且部分鱼的腹部膨大或胸部呈微黄色等（雷衍之等，1985；章征忠等，1999）。为了应对盐碱胁迫，鱼类会通过启动信号传导、酸碱平衡、渗透压、代谢、呼吸和免疫等调控机制，在一定范围内维持机体的生理平衡，但这个生理过程会消耗能量，且涉及众多基因的相互作用（郭雯翡等，2012；Yao et al.，2012）。刘济源等（2012）在对青海湖裸鲤进行碳酸盐碱度胁迫的研究中，发现青海湖裸鲤血浆渗透压和Na+、Cl-、Ca2+离子浓度在碳酸盐碱度胁迫96 h内未出现显著变化；郭雯翡等（2012）研究盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃基因表达的差异情况，结果表明，高盐碱胁迫会改变鱼类的渗透压和酸碱平衡，对免疫系统产生一定的抑制作用，即鱼类通过增强离子调控、提高血清尿素氮浓度、合成应激蛋白等生理活动来维持渗透压和酸碱平衡，缓解应激反应；王卓等（2013）研究发现，在碳酸盐碱度胁迫下青海湖裸鲤的SOD、ACP和AKP活性均在发生显著变化后又快速恢复到初始水平。【本研究切入点】尼罗罗非鱼是世界性的淡水养殖鱼类，对碳酸盐碱度的耐受性较一般养殖鱼类高（史为良，1981），在碳酸盐碱度41.6 mmol/L、pH 9.42的水体中仍可存活（雷衍之等，1985），但至今尚未明确碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼体内血清pH和游离氨浓度的影响，在其他鱼类上也未见相关的研究报道。【拟解决的关键问题】对尼罗罗非鱼进行碳酸盐碱度胁迫后测定其体内血清pH、游离氨浓度及肾组织碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因的相对表达量，以期从生理生化角度揭示碳酸盐碱度对罗非鱼的毒性及其相应的耐受机制，为耐盐碱罗非鱼育种及生产应用提供理论指导。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

尼罗罗非鱼于2014年10月取自上海海洋大学罗非鱼种质资源试验站，淡水饲养于上海海洋大学养殖中心控温循环水族箱中，水温（25.3±0.8）℃，光照条件为室内自然光，每天定时投食2次，及时清理粪便和残余饵料。选取体质健康、规格均匀（平均体重82.2±5.4 g）的个体进行急性胁迫试验。试验用盐碱水体均提前配置，并根据水族箱体积计算所需NaHCO3（分析纯），将相应NaHCO3加入到完全曝气的自来水中，均匀搅拌，连续充氧48 h，待其稳定后使用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 设4个碳酸盐碱度处理组（处理1～4），对应的NaHCO3浓度分别为4.0、6.0、8.0和10.0 g/L，以充分曝气的自来水为对照组（CK）。其中，处理1（4.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 8.90；处理2（6.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.4 mg/L、氨氮0.42 mg/L、pH 9.09；处理3（8.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.3 mg/L、氨氮0.46 mg/L、pH 9.10；处理4（10.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 9.20。试验前1 d开始禁食，试验过程中不投放饵料。将试验鱼从淡水中捞出，直接放入各碳酸盐碱度处理组中，每组35尾鱼，设3个重复。

1. 2. 2 血样采集 试验开始后每隔24 h全部换水1次，保持水体理化指标相对稳定，连续充氧，在碱胁迫后0.5、1.0、4.0、6.0、9.0、12.0、18.0、24.0、36.0和48.0 h分别采样，每个重复随机取3尾。采用一次性无菌注射器从鱼尾静脉处抽血，每尾鱼抽血时间不超过5 min，血样注入抗凝剂处理的1.5 mL离心管中，室温放置0.5 h后5000 r/min离心10 min，取上层血清。

1. 2. 3 血清pH测定 采用FE20-FiveEasy PlusTM pH计测定血清pH。将分离获得的血清转移到自制柱状容器（内径1.5 cm，保证血清可浸没探头）中测定，同一样本测定3次，取其平均值。测定前校准仪器，在每次测量结束后用蒸馏水充分润洗探头且用吸水纸吸干再进行下次测量。

1. 2. 4 血清游离氨浓度测定 采用南京建成生化技术有限公司生产的血氨测试盒（无蛋白滤液法）测量血氨（游离氨）含量。在血清中立刻加入定量或过量的钨酸钠和硫酸溶液，使蛋白质沉淀，在此过程中血清中的氨和硫酸反应生成硫酸铵而存在于上清液中，过滤后以酚—次氯酸显色，置于波长630 nm处测定吸光值（刘福和曾芝兰，2007）。

1. 2. 5 肾组织CA基因和GS基因mRNA表达检测 参照GenBank中尼罗罗非鱼β-actin序列（EU887951）、CA-4（XM_003460 163）、GS（XM_003444304.2）cDNA序列，用Primer Premier 5.0设计引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成引物。荧光定量PCR具体操作步骤参照赵丽慧等（2014b）的方法。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析，包括单因素方差分析及Duncans多重比较。

2 结果与分析

2. 1 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼的毒性

试验罗非鱼在CK组中无应激现象，游动平缓，水质清洁无泡沫。处理1和处理2中的罗非鱼在放入初期表现为快速游动、呼吸加快，之后逐渐减缓，胁迫过程中未出现死鱼现象；而处理3和处理4陆续出现死鱼，且处理4脅迫过程中出现死鱼的时间明显早于处理3，具体临床症状表现为：罗非鱼焦躁不安，沿着水槽边缘狂游，随后身体失去平衡，侧翻或倒游；体表和鳃部附有大量黏液，部分鱼身体扭曲，以尾部最明显；死后罗非鱼眼部凸起发黑，体表泛青黑色（图1）。

2. 2 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼血清pH的影响

正常水温（25 ℃）条件下，CK组罗非鱼血清pH较稳定，维持在7.69～7.75（表2）。在各碳酸盐碱度处理组中，胁迫1.0 h后罗非鱼血清pH均发生显著变化（P<

0.05，下同）。处理1和处理2的罗非鱼血清pH呈先升高后降低的变化趋势，分别于胁迫9.0和12.0 h时达到各自的峰值（7.97和8.03），胁迫48.0 h后，血清pH明显高于CK组。处理3的罗非鱼在胁迫9.0 h后，其血清pH为8.11，之后陆续出现死鱼，至胁迫12.0 h后全部死亡而无法取样测定；处理4的罗非鱼则在胁迫4.0 h后全部死亡，无法取样测定。

2. 3 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼血清游离氨浓度的影响

由表3可知，CK组罗非鱼血清游离氨浓度维持在170.73～178.51 μmol/L。在各碳酸盐碱度处理组中，胁迫1.0 h后罗非鱼血清游离氨浓度均发生显著变化。处理1和处理2的罗非鱼血清游离氨浓度呈先升高后降低的变化趋势，均在胁迫12.0 h后达到各自的峰值（490.01和525.66 μmol/L），胁迫48.0 h后游离氨浓度仍明显高于CK组。处理3的罗非鱼在胁迫9.0 h后，其血清游离氨浓度为486.28 μmol/L，之后陆续出现死鱼，至胁迫12.0 h后罗非鱼全部死亡；处理4出现死鱼的时间明显早于处理3，在胁迫4.0 h后罗非鱼全部死亡。

2. 4 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼肾组织中CA基因表达的影响

由图2可以看出，经4.0和6.0 g/L NaHCO3胁迫处理后，尼罗罗非鱼肾组织中CA基因表达量呈先增加后减少的变化趋势，均在胁迫12.0 h后达到峰值。说明经急性碳酸盐碱度胁迫后，CA基因参与相应的应答调控过程（离子转运），且经过一段时间后罗非鱼自身逐步适应胁迫环境，体内达到新的平衡点。

2. 5 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼肾组织中GS基因表达的影响

由图3可以看出，经4.0和6.0 g/L NaHCO3胁迫处理后，尼罗罗非鱼肾组织中GS基因表达量也呈先增加后减少的变化趋势，均在胁迫12.0 h后达到峰值。说明经急性碳酸盐碱度胁迫后，GS基因参与相应的应答调控过程（氨氮代谢），且经过一段时间后罗非鱼自身逐步适应胁迫环境，体内达到新的平衡。

3 讨论

碱度是水产养殖中的重要水质指标，通常是指水体中能与酸发生中和作用的物质总量，即总碱度反映了水体对pH的缓冲能力。一般认为，养殖水体碱度不宜过低，但碱度过高对水产动物的毒性作用同样不可忽视，尤其是碱度和pH均较高时（雷衍之等，1985）。碱胁迫对鱼类的毒性作用复杂，涉及到总碱度与pH的协同毒性作用（Wilkie and Wood，1996；Parra and Baldisserotto，2007），包括：（1）OH-、HCO3-和 CO32-等离子直接作用于鱼类的鳃表面上皮细胞，而对鳃造成器质性伤害；（2）血液HCO3-浓度升高使得pH上升，破坏体内酸碱平衡，导致碱中毒；（3）血液pH升高导致H+浓度降低，从而致使代谢产生的NH3无法与H+结合形成NH4+排出体外，导致氨中毒。本研究中，尼罗罗非鱼血清pH和游离氨浓度在碳酸盐碱度胁迫后，首先呈上升趋势且明显高于CK组，说明碳酸盐碱度对尼罗罗非鱼的生理状态已产生影响，也进一步验证游离氨浓度会随血清pH升高而升高的观点，即碳酸盐碱度胁迫过程中出现死鱼是因体内血清pH和游离氨浓度共同升高的结果。

鱼类应对碱胁迫过程中的碱中毒主要是通过以下几种途径：（1）提高鱼鳃泌氯细胞中Cl-/HCO3-转运蛋白的表达量，排出体内HCO3-（Alper et al.，2002）；（2）降低肾脏对HCO3-重吸收，提高NaCl重吸收，调节体液pH（Gilmour et al.，2007）；（3）进入肠道中的碳酸盐会与Ca2+反应，生成CaCO3沉淀，与代谢废物一同排出体外（Wood et al.，2007）等。此外，鱼类还可通过其他方式应对碱胁迫的氨中毒：（1）合成尿素加强氨排泄（Wood and Marshall，1994）；（2）调节代谢降低氨的产生而适应碱性环境（Wilkie et al.，1994）；（3）提高对氨的耐受性来适应高碱环境（Wright and Wood，1988）。本研究中，尼罗罗非鱼血清pH和游离氨浓度在低碳酸盐碱度（4.0和6.0 g/L）胁迫后，呈先升高后回落的变化趋势，即反应了尼罗罗非鱼应对逆境的自我调控过程和能力。近年来，研究发现鱼类在高碱胁迫或环境下存在大量表达差异显著的相关基因（郭雯翡等，2012；Yao et al.，2012），如胁迫后显著上调的CA基因和GS基因。CA主要通过催化可逆反应（HCO3-+H+■CO2+H2O）降低HCO3-（赵丽慧等，2014b），而GS可将体内氨氮转换成中性无毒的谷氨酰胺（陈胜勇等，2010）。本研究结果表明，尼罗罗非鱼肾组织中CA基因和GS基因表达量均随胁迫时间的推移而呈先升高后降低的变化趋势，与血清pH和游离氨浓度的变化趋势一致，故推测这两个基因在尼罗罗非鱼血清pH和游离氨的调控中发挥了重要作用。

一些鱼类经过长期的自然选择可在pH显著偏高的碱性水体中生存，如肯尼亚马加迪湖（pH 10.0）的马加迪湖罗非鱼（Alcolapia graha）（Seegers and Tichy，1999），美国皮拉米德湖（pH 9.4）的克拉克大麻哈鱼（Oncorhyn chusclarkihen shawi）（Coleman and Johnson，1988），我国达里诺尔湖（pH 8.25～9.60）的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）（Xu et al.，2013a，2013b）、青海湖的青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）（郭雯翡等，2012）。相对而言，绝大多数淡水鱼适合在pH接近8.0的水体中生长，但不同种或不同个体对碱性环境的适应性存在较大差异。本研究中，当碳酸盐碱度达8.0 g/L时，胁迫数小时后便出现大量死鱼；当碳酸盐碱度达10.0 g/L时，仅胁迫1.0 h即开始出现死鱼现象，与赵丽慧等（2014a）的研究结果相似。就血清pH而言，大多数鱼类正常情况下维持在7.7～8.0（Aidakatsumi，2002），在低pH（4.0）胁迫96 h后，草鱼动脉血液pH由7.85降低至7.58（余日清和贺锡勤，1992）。本研究中，碳酸盐碱胁迫下尼罗罗非鱼中血清pH维持在7.81～8.14，濒死前的pH为8.11和8.14，故推测尼罗罗非鱼体内维持酸碱平衡、能量耐受的pH上限在8.10附近。目前，有关鱼类血清游离氨浓度的研究较少，正常人体内游离血氨含量极低（20～60 μmol/L），正常大鼠脑皮层氨含量为280 μmol/L，但中断脑循环5 min后迅速升高到1220 μmol/L（刘福和曾芝兰，2007）。本研究结果表明，碳酸盐碱胁迫下尼罗罗非鱼血清游离氨浓度在180.32～ 525.66 μmol/L，濒死前的前血清游离氨浓度为365.89和486.28 μmol/L，因此推测尼罗罗非鱼可耐受的游离氨浓度上限为525.66 μmol/L，在低于该浓度出现死鱼现象可能是体内酸碱失衡或其他原因所引起，具体原因有待进一步探究。

4 结论

尼罗罗非鱼能耐受的血清pH上限在8.10附近，耐受的游离氨浓度为525.66 μmol/L。在低碳酸盐碱度（小于6.0 g/L）胁迫下，尼罗罗非鱼可通过生理调控血清pH和游离氨浓度而适应胁迫逆境，且CA和GS参与了相应离子的转运及氨氮代谢。

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（責任编辑 兰宗宝）