火龙果总黄酮提取工艺优化

孙艳 杨志伟

摘要：【目的】优化火龙果总黄酮提取工艺条件，为火龙果的综合开发与利用提供参考依据。【方法】以红皮红肉种火龙果为试验材料，在单因素试验的基础上，采用正交试验设计优化火龙果总黄酮的乙醇回流提取工艺，并通过响应面法优化其超声波辅助提取工艺，确定最佳提取工艺条件。【结果】乙醇回流提取火龙果总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%、提取温度80 ℃、料液比1∶25、提取时间2 h，在此条件下火龙果总黄酮提取量为18.07 mg/g；超声波辅助提取火龙果总黄酮的最佳工艺条件为：超声波功率250 W、乙醇体积分数80%、料液比1∶25、提取温度80 ℃、超声波时间20 min，在此条件下火龙果总黄酮提取量为19.58 mg/g。【结论】超声波辅助提取法操作简单、耗时短、提取效率高，效果优于乙醇回流提取法，可用于火龙果总黄酮的工业化提取。

关键词： 火龙果；总黄酮；提取工艺；正交试验设计；响应面法

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1001-08

0 引言

【研究意义】火龙果又称红龙果、青龙果、仙蜜果等，为仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus undatus）植物，原产于墨西哥及美洲中南部的热带森林地区，是一种热带亚热带新型水果（Nerd et al.，2002），目前在我国海南、广西、广东、贵州、福建等地已有一定规模种植。火龙果富含蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸、维生素及水溶性膳食纤维等，矿物质元素含量也较丰富，尤其是钾、钙、镁、磷、铁含量较高（陈杰等，2004；Villalobos-Gutiérrez et al.，2012），具有很高的营养价值。已有研究表明，火龙果果肉及果皮中含有的多酚类和黄酮类物质具有抗氧化、清除自由基等作用，并可抑制BF16黑色素瘤细胞的生长（Wu et al.，2006）。因此，研究火龙果中总黄酮的提取工艺，对火龙果的深入开发利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外关于火龙果中黄酮类化合物的研究主要集中在其含量测定及抗氧化活性分析方面。郭璇华等（2010）优化火龙果茎中黄酮类化合物的分光光度法测定条件及其分离提取条件，结果表明，最佳分离提取条件为：乙醇体积分数70%、料液比1∶40、提取温度75 ℃、提取时间3 h；火龙果茎干品中黄酮类化合物的含量为0.49%。王晓波等（2011）通过单因素试验和正交试验优化乙醇回流提取火龙果皮总黄酮的工艺条件，并评价火龙果皮乙醇提取物的抗氧化活性，结果表明，在最佳提取工艺条件（乙醇体积分数80%、料液比1∶30、温度80 ℃、时间0.5 h）下提取两次，火龙果皮总黄酮的提取率为10.9 mg/g；火龙果皮中总黄酮具有较强的体外抗氧化活性。Kim等（2011）研究表明，火龙果果肉和果皮中均分布有不同含量的酚类物质及黄酮类化合物，其中果皮提取物具有更高的清除自由基活性。王晓波等（2012）的研究结果表明，火龙果皮总黄酮对羟基自由基有一定的清除效果，对菜籽油有明显的抗氧化作用，且呈量效关系。罗小艳和郭璇华（2014）采用紫外—可见分光光度法测得火龙果花中总黄酮含量为0.747%。【本研究切入点】黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗溃疡等作用，还有抑菌抗病毒、扩张冠状动脉、降血脂活性等功效（Porfírio et al.，2014；段浩平等，2014），但目前对火龙果总黄酮提取多采用乙醇回流法，尚未见利用超声波辅助提取的相关研究报道。【拟解决的关键问题】以红皮红肉种火龙果为试验材料，分别采用正交试验设计和响应面法优化火龙果总黄酮的乙醇回流提取工艺和超声波辅助提取工艺，确定火龙果总黄酮的最佳提取工艺条件，为火龙果的综合开发与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验选用广西产的红皮红肉种火龙果，购自南宁市五里亭综合批发市场，于4 ℃下贮藏备用。芦丁标准品购自中国食品药品检定研究院，乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为国产分析纯，购自广东光华科技股份有限公司。主要仪器設备：紫外分光光度计（UV-2102PC，上海尤尼柯公司）、水浴锅（HH-S2，金坛市医疗仪器厂）、智能温控双频超声波合成萃取仪（XH-2008DE，北京祥鹄科技发展有限公司）、粉碎机（FW100，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平（FA2204，上海市安亭电子仪器厂）。

1. 2 火龙果总黄酮提取工艺流程

火龙果→清洗去皮→真空冷冻干燥、粉碎→乙醇回流提取（超声波提取）→抽滤→定容→火龙果总黄酮提取液。

1. 3 芦丁标准曲线绘制

参考郑义等（2014）的方法，试验重复操作3次，取其平均值，以芦丁质量浓度为横坐标（C）、吸光值为纵坐标（A），绘制芦丁标准曲线，回归方程为A=0.0120C-

0.0032（R2=0.9997）。

1. 4 总黄酮含量测定

取2.0 mL火龙果提取液置于25.0 mL容量瓶中，按照芦丁标准曲线方法操作。根据芦丁标准曲线回归方程计算火龙果总黄酮含量，计算公式如下：

总黄酮提取量（mg/g）=C×V×n/m

式中，C为从回归方程计算得到的火龙果黄酮类化合物质量浓度（mg/mL）；V为提取液定容体积（mL）；n为稀释倍数；m为火龙果粉质量（g）。

1. 5 乙醇回流提取火龙果总黄酮最佳工艺条件确定

1. 5. 1 单因素试验 选取乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间4个因素进行单因素试验，水平梯度分别设置为：乙醇体积分数50%、60%、70%、80%和90%，提取温度50、60、70、80和 90 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和4.0 h。

1. 5. 2 正交试验 根据单因素试验结果，提取时间2.0 h后对总黄酮提取量影响不明显，故选取乙醇体积分数、提取温度、料液比3个影响总黄酮提取量的主要因素进行L9（33）正交试验设计，优化火龙果总黄酮的乙醇回流提取工艺。试验设计见表1。

1. 6 超声波辅助提取火龙果总黄酮最佳工艺条件确定

1. 6. 1 单因素试验 超声波提取试验各单因素水平梯度分别为：提取温度50、60、70、80和90 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，超声波时间5、10、15、20、25和30 min，乙醇体积分数50%、60%、70%、80%和90%。

1. 6. 2 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 8.0.6软件，选择影响火龙果总黄酮提取效果的料液比、乙醇体积分数、提取温度3个因素为自变量，以总黄酮提取量为响应值进行响应面优化试验。响应面因素水平如表2所示。

1. 7 统计分析

采用SPSS 17.0、Design-Expert 8.0.6及Excel 2007对试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 乙醇回流提取火龙果总黄酮单因素试验结果

2. 1. 1 提取温度对火龙果总黄酮提取量的影响 由图1可知，提取温度为50～80 ℃时，随着提取温度的不断升高，分子的扩散及渗透速度加快，火龙果总黄酮提取量也不断增加；当提取温度为80 ℃时，总黄酮提取量达最大值，显著高于其他提取温度的总黄酮提取量（P<0.05，下同），之后随着提取温度的继续升高，其总黄酮提取量反而降低。这是因为提取温度过高时，破坏了黄酮类物质结构，同时提取溶剂乙醇严重挥发。因此，提取温度选择80 ℃较合适。

2. 1. 2 提取时间对火龙果总黄酮提取量的影响 由图2可以看出，提取时间为0.5～2.0 h时，火龙果总黄酮提取量随提取时间的延长而逐渐增加，且存在显著性差异；超过2.0 h后，总黄酮提取量增加不显著（P>0.05，下同），可能是黄酮类化合物基本提取完全。综合考虑，乙醇回流提取2.0 h较合适。

2. 1. 3 乙醇体积分数对火龙果总黄酮提取量的影响 由图3可知，乙醇体积分数对火龙果总黄酮提取量有显著影响，当乙醇体积分数为50%～80%时，总黄酮提取量随乙醇体积分数的增大而不断增加，乙醇体积分数为80%时，总黄酮提取量达最大值，超过80%后，提取量有所下降。这可能是乙醇体积分数为80%时，溶剂极性与火龙果黄酮类物质极性相似，根据相似相溶原理，黄酮类物质溶出较多（董雯雯，2008）；之后乙醇体积分数继续增大，一些糖类、色素、脂溶性物质等大量溶出，导致黄酮类物质溶解度下降，从而总黄酮提取量明显降低（林珊等，2012）。因此，选择80%乙醇为提取溶剂较合适。

2. 1. 4 料液比对火龙果总黄酮提取量的影响 由图4可知，料液比为1∶10～1∶25时，随着料液比的不断减小，黄酮类化合物逐渐增加，不同料液比的总黄酮提取量之间有显著差异，料液比为1∶25时，总黄酮提取量达最大值；之后随着料液比的继续减小，总黄酮提取量反而下降，且会给后续处理带来不利，同时造成资源浪费。综合考虑，料液比以1∶25为宜。

2. 2 乙醇回流提取火龙果总黄酮工艺条件的正交试验设计优化分析

从表3可以看出，3个因素对火龙果总黄酮提取量的影响为：乙醇体积分数（A）>料液比（C）>提取温度（B）。正交试验设计优化得到乙醇回流提取火龙果总黄酮的最佳工艺条件为A2B2C2，即乙醇体积分数80%、提取温度80 ℃、料液比1∶25。由于优化得到A2B2C2在L9（33）试验组中未出现，因此在最佳条件下进行3次平行验证试验，测得火龙果总黄酮平均提取量为18.07 mg/g，高于正交试验组合中任意一组。正交试验设计确定的条件为乙醇回流提取火龙果总黄酮的最佳工艺。

2. 3 超声波辅助提取火龙果总黄酮单因素试验结果

2. 3. 1 超声波时间对火龙果總黄酮提取量的影响 由图5可知，超声波20 min，火龙果总黄酮提取量不断增大，继续延长超声波时间，总黄酮提取量无明显变化，同时超声波时间延长，提取溶剂挥发越严重。因此，超声波时间以20 min为宜。

2. 3. 2 提取温度对火龙果总黄酮提取量的影响 由图6可知，不同提取温度的火龙果总黄酮提取量有显著性差异。当低于80 ℃时，随着提取温度不断升高，总黄酮提取量显著增大；提取温度为80 ℃时，总黄酮提取量达最大值，之后提取温度升高，提取量降低。因此，提取温度选择80 ℃为宜。

2. 3. 3 料液比对火龙果总黄酮提取量的影响 由图7可知，料液比高于1∶20时，不同料液比的火龙果总黄酮提取量有显著性差异，降低料液比，总黄酮提取量不断增大；料液比为1∶20时，总黄酮提取量达到峰值，此后随着料液比的继续降低，总黄酮提取量无显著变化。因此，确定最佳料液比为1∶20。

2. 3. 4 乙醇体积分数对火龙果总黄酮提取量的影响 从图8可以看出，乙醇体积分数过高或过低均不利于火龙果黄酮类物质的提取，乙醇体积分数低于80%时，总黄酮提取量随乙醇体积分数的增大而显著提高，乙醇体积分数为80%时，总黄酮提取量达到峰值；继续增大提取溶剂体积分数，由于沸点降低，乙醇严重挥发，黄酮类物质不能彻底提取，而导致提取量降低。因此，以80%乙醇为提取溶剂较好。

2. 4 响应面法优化超声波辅助提取火龙果总黄酮的工艺条件分析

2. 4. 1 回归方程模型的建立和显著性检验 采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken进行试验设计，优化出的17组试验安排及试验结果见表4，得到总黄酮提取量（Y）与乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、料液比（X3）的二次多元回归方程模型为：Y=-169.802+

2.4419X1+1.9231X2+1.5387X3+0.0106X1X2-0.0129X1X3+

5.9630×10-3X2X3-0.0190X12-0.0183X22-0.0214X32。

从图11可以看出，固定乙醇体积分数不变，最优点在料液比1∶20、提取温度80 ℃附近。图中等高线为椭圆形，表明料液比与提取温度的交互影响显著，对火龙果总黄酮提取量的影响较大。提取温度的坡度比料液比更陡峭，沿提取温度轴向等高线也更为密集，说明提取温度对总黄酮提取量的影响较料液比更明显。

对上述数学模型进行方差分析，结果见表5。由表5中P可以看出：模型<0.0001，表明该模型极显著；失拟项0.2451>0.05，不显著。决定系数R2=0.9895，校正后的R2=0.9759，表明模型对试验拟合度高，能够较准确地反映出各因素与响应值间的关系（Sin et al.，2006）。因此，可用此模型对火龙果总黄酮提取量进行预测。由表5回归模型的方差分析可以看出，一次项X2和X3、二次项X12和X22、交互项X1X2、X1X3和X2X3对总黄酮提取量的影响均达极显著水平（P<0.01）；一次项X1和二次项X32的影响不显著。

2. 4. 2 响应面优化结果分析 由图9可知，固定料液比不变，提高乙醇体积分数和提取温度，火龙果总黄酮提取量先升高后降低，当乙醇体积分数为80%、提取温度为80 ℃时，总黄酮提取量最大。响应曲面为开口向下的凸形曲线，提取温度与乙醇体积分数交互作用的等高线为椭圆，表明二者对总黄酮提取量的交互作用明显。等高线在沿提取温度轴向上分布比较密集，表明提取温度对总黄酮提取量的影响较乙醇体积分数影响更显著。

如图10所示，固定提取温度不变，火龙果总黄酮提取量随料液比的减小而升高，随乙醇体积分数的增大呈先升高后降低趋势，在料液比1∶20、乙醇体积分数80%附近达响应值的最高点。图中等高线呈椭圆，表明二者交互作用较明显，对总黄酮提取量的影响显著。沿乙醇体积分数轴向等高线变化密集，沿料液比轴向等高线较稀疏；响应曲面上，乙醇体积分数坡度比料液比坡度陡峭，说明乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响相对料液比更明显。

2. 4. 3 提取工艺条件的确定及可靠性验证 通过回归方程模型，以响应值最大为指标进行提取条件的最优化，可得到超声波辅助提取火龙果总黄酮的最佳理论工艺参数：料液比1∶23、提取温度79 ℃、乙醇体积分数78%，在最佳工艺条件下模型预测的最大总黄酮提取量为19.73 mg/g。为操作方便，确定最佳提取工艺为：超声波功率250 W、乙醇体积分数80%、料液比1∶25、提取温度80 ℃、超声波时间20 min，在此条件下进行3次平行试验，总黄酮平均提取量为19.58 mg/g，与预测值的相对误差为0.73%，偏差较小。表明该模型可用于优化火龙果总黄酮的超声波辅助提取工艺。

3 讨论

目前，国内外对于植物中黄酮类物质的提取工艺研究较成熟，提取方法也很多，如水提法、有機溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、加压流体萃取法、生物酶提取法等（Ganzler et al.，1990；郭雪峰和岳永德，2007；庞玉新等，2014）。有机溶剂提取法常选用乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿和乙醚等有机溶剂（尹芹等，2012），其中乙醇具有无刺激性气味、成本低、无毒、不会造成环境污染等优点，常用作黄酮类物质的提取溶剂。

本研究分别采用乙醇回流提取法和超声波辅助提取法提取火龙果总黄酮，结果表明，以80%乙醇为提取溶剂，在提取温度80 ℃、料液比1∶25的条件下回流提取2 h，火龙果总黄酮提取量为18.07 mg/g；以80%乙醇为提取溶剂，在超声波功率250 W、料液比1∶25、提取温度80 ℃的条件下超声波提取20 min，火龙果总黄酮提取量为19.58 mg/g。对比这两种方法发现，虽然提取溶剂乙醇的体积分数、提取温度、料液比3个因素水平均相同，但超声波辅助提取法所需时间明显缩短，且得到的火龙果总黄酮提取量稍高于乙醇回流提取法。高温条件下过长时间的提取不仅造成溶剂挥发、浪费资源、增加耗能，还可能破坏火龙果中黄酮类物质的结构。超声波辅助提取的作用机理主要是利用超声波的热效应、机械粉碎作用及空化作用，对火龙果进行超声处理，可以使其内部组织的温度迅速升高，加快活性物质的溶出；超声波的机械粉碎作用主要破坏火龙果的组织结构，引起细胞结构的损伤，从而加强组织细胞内活性物质的释放、扩散及溶解，以提高火龙果黄酮类化合物的提取量（李欣和王步军，2010）。此外，超声波辅助提取法操作简单，容易控制。可见，超声波辅助提取法在实用性及经济性上均明显优于乙醇回流提取法，适用于工业化生产，不仅符合绿色生产的工业要求，还能够提高生产效率及生产效益，故对于火龙果总黄酮的提取宜采用超声波辅助提取法。

本研究对比分析传统的乙醇回流提取法和超声波辅助提取法提取火龙果总黄酮的效果，确定了总黄酮提取的最佳工艺条件，可为火龙果资源的进一步研发和利用提供一定的参考依据；但目前有关其黄酮类物质的分离纯化及结构分析的研究尚未见文献报道，故下一步可对火龙果中总黄酮的结构鉴定等问题进行深入探究。

4 结论

超声波辅助提取法操作简单、耗时短、提取效率高，效果优于乙醇回流提取法，可用于火龙果总黄酮的工业化提取。

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（責任编辑 罗 丽）