香蕉茎秆单宁酸提取纯化及其抗氧化性

徐树英 谭蔚 张玉苍

摘 要 以香蕉茎秆为原料，采用溶剂提取法进行单宁酸提取，在单因素试验设计的基础上，通过正交试验优化香蕉茎秆单宁酸提取工艺，采用大孔树脂吸附技术对粗提物进行分离纯化。纯化物采用傅里叶红外光谱（FTIR）测定其官能团，通过凝胶渗透色谱（GPC）测定纯化物的分子量及分子量分布。通过测定其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力，考察香蕉茎秆单宁酸的抗氧化性。结果表明：香蕉茎秆单宁酸最佳提取工艺为：乙醇浓度50%，提取时间90 min，料液比1 ∶ 11，提取温度50 ℃，在此条件下单宁酸提取量为17.9 mg/g。纯化工艺为：5 mg/mL上样，流速为1.5 mL/min过AB-8型大孔树脂柱，最后用60%乙醇洗脱。FTIR结果表明，该纯化物为多羟基酚酯类化合物；GPC结果显示香蕉茎秆单宁酸分子质量在3.43×104～4.43×104之间。经过DPPH法测出样品浓度达到0.6 mg/mL时，其DPPH自由基清除率为86.59%。

关键词 香蕉茎秆；单宁酸；溶剂提取；抗氧化活性

中图分类号 TQ35 文献标识码 A

Abstract In this paper， tannins were extracted from banana pseudostem by solvent the extraction method. On the basis of single factor experiment design， the banana pseudostem tannins extraction process was optimized by the orthogonal test. The extracts were purified by macroporous resin adsorption. The purified samples were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）and Gel Permeation Chromatography（GPC）. The antioxidant properties of the banana pseudostem tannins were measured by their capacity of clearing free radical of DPPH. The results showed that the optimized condition were the ethanol concentration 50 wt.%， the extraction time 90 min， solid-liquid ratio 1 ∶ 11， the extracting temperature 50 ℃. Under this condition， the highest amount of extraction of banana pseudostem tannins was 17.9 mg/g. The purification process indicated that the sampling concentration was 5 mg/ml， and the current speed was 1.5 ml/min through macroporous resin column AB-8， and finally eluted with 60 wt.% ethanol solution. FTIR results indicated that the purified banana pseudostem tannins was a multi-hydroxy phenolic exter compound. The GPC results showed that the molecular weight of the banana pseudostem tannins was between 3.43×104-4.43×104. The DPPH free radical scavening rate was 86.59% when the concentration of sample was 0.6 mg/mL.

Key words Banana pseudostem； Tannin； Solvent extraction； Antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.020

香蕉是世界贸易量及鲜果消费量最大宗的水果，被联合国粮农组织（FAO）定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第4大粮食作物。香蕉产业是海南省发展热带现代农业和高效农业的重要支柱产业和优势特色产业。2012年全省香蕉收获面积达到6.1万hm2，产量达200万t，现已成为全国第3大香蕉生产大省[1-2]。香蕉在生产的同时会产生75%左右的茎叶副产品。如对香蕉茎秆资源进行合理开发，可减少环境污染，提高资源二次利用率，具有良好的经济效益和社会效益[3]。

单宁酸是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物[4]。它的多酚羟基化学结构和独特的化学性质表现出较强的抗氧化生物活性，可用作抗氧化剂[5]。单宁酸在日用化学、医药、食品、皮革等行业获得广泛应用[6]，但其结构复杂，人工合成困难。因此从香蕉茎秆中提取单宁酸，制备天然抗氧化剂，是香蕉茎秆资源综合利用的有效途径。至今，国内外对香蕉茎秆提取单宁酸的研究鲜有报道。本课题以香蕉茎秆为原料，采用溶剂提取法进行单宁酸提取，在单因素试验设计的基础上，通过正交试验优化香蕉茎秆单宁酸提取工艺，并确定较佳的纯化工艺技术参数。采用傅立叶红外光谱仪（fourier transformed infra red spectroscopy，FTIR）对获得的香蕉茎秆单宁酸纯化物官能团进行分析，并通过凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography，GPC）测定其相对分子量分布；测定香蕉茎秆单宁酸纯化物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力，为香蕉茎秆资源的开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及试剂 香蕉茎秆粉末：新鲜香蕉茎秆洗净，去除老化、病变部分，切成小块置于105 ℃通风干燥箱内15 min，钝化多酚氧化酶。然后在60 ℃通风干燥箱内烘干，经粉碎过100目筛后装袋置于干燥皿中待用。

试验试剂：95%乙醇，无水乙醇，广东光华科技股份有限公司；单宁酸，广东光华化学厂有限公司；碳酸钠（无水），广州市番禺力强化工厂；浓盐酸，广州化学试剂厂；钨酸钠，天津市大茂化学试剂厂；磷钼酸，天津市福晨化学试剂厂；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），东京化成工业株式会社；氢氧化钠，广州化学试剂厂，以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 真空干燥箱（DZF-6050）；旋转蒸发仪（RE-2000B）；紫外可见分光光度计（UV2000）；恒温振荡培养箱（BS-1E）；医用离心机（TG18G-Ⅱ）；循环水式多用真空泵（SHB-ⅢS）；粉碎机（GS-02）；傅里叶变换红外光谱仪（TENSOR27，德国Bruker公司）；凝胶色谱仪（Waters1515，美国waters公司）；其他均为常规仪器。

1.2 方法

1.2.1 香蕉茎秆单宁酸提取工艺流程 香蕉茎秆单宁酸提取工艺流程如图1所示。

单因素试验：影响香蕉茎秆单宁酸提取量的因素主要有4个：乙醇浓度、料液比（g/mL）、提取时间和提取温度。按照图1工艺流程进行香蕉茎秆单宁酸的提取，分别对4个因素进行单因素试验，再选取各适宜因素选出较佳工艺。乙醇浓度采用40%、50%、60%、70%、80%、90% 等6个水平；料液比采用1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 12、1 ∶ 15等5个水平；提取时间采用30、60、90、120、150 min等5个水平；提取温度采用30、35、40、45、50、55 ℃等6个水平。

对纯化工艺进行上样浓度、流速和洗脱溶剂浓度的单因素试验。将样品配置为10 mg/mL的单宁酸水溶液以0.5、1.5、4、6、10 mL/min流速分别上样，进行AB-8树脂对单宁酸的动态吸附试验，考察不同上样液流速对大孔径吸附树脂未吸附量的影响；将样品配置为1、2、4、6、8、10 mg/mL的单宁酸水溶液以4 mL/min流速分别上样，考察不同上样液浓度对大孔径吸附树脂未吸附量的影响；采用不同的乙醇浓度考察对树脂解吸量的影响。

正交试验设计：以单因素试验与分析结果为依据，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为考察因素，选择4因素3水平构建正交设计表进行优化香蕉茎秆单宁酸提取工艺，因素及水平选取见表1。

1.2.2 香蕉茎秆单宁酸含量测定 单宁酸标准曲线的绘制：称取单宁酸50 mg于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，混匀。再用蒸馏水稀释10倍即为0.1 mg/mL标准溶液。吸取单宁酸标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置于盛有6 mL蒸馏水的10 mL容量瓶中，加Folin-Denis试剂0.5 mL及饱和Na2CO3溶液1 mL，加水稀释至10 mL，充分混合，并于30 min后在650 nm处测定吸光度值。以吸取标准溶液体积为纵坐标，吸光度为横坐标作图，得到单宁酸标准曲线[7]。单宁酸含量Y与吸光值X之间的直线方程为：Y=68.471X+0.000 8，相关系数R为0.999 3。

单宁酸含量测定：称取0.1 g单宁酸提取工艺试验得到的粗提胶状物于50 mL容量瓶中定容为2 mg/mL。吸取1 mL于容量瓶中并加入30 mL蒸馏水，再加入Folin-Denis试剂2.5 mL及饱和Na2CO3溶液5 mL定容至50 mL，根据单宁酸标准曲线测定含量，后期试验采用旋转蒸发浓缩后液体稀释至100 mL。取1 mL于容量瓶中并加入30 mL蒸馏水，再加入Folin-Denis试剂2.5 mL及饱和Na2CO3溶液5 mL定容至50 mL，根据单宁酸标准曲线计算测定单宁酸含量。

1.2.3 香蕉茎秆单宁酸表征测定 纯化物相对分子量分布测定：采用美国waters公司凝胶色谱仪Waters1515进行分析，凝胶渗透色谱（GPC）法测定相对分子质量。色谱条件：流动相为水相；流速0.6 mL/min；进柱温40.0 ℃，出柱温45.0 ℃；进样量10 μL；样品浓度1 mg/mL；单分散试样标准品：聚乙烯醇，分子量范围600～3×106。

傅里叶红外光谱（FTIR）分析：把香蕉茎秆单宁酸纯化物粉末与KBr混合压片制样，采用德国Bruker公司生产的TENSOR27傅立叶红外光谱仪对样品在400～4 000 cm-1区内进行红外光谱分析，扫描信号累加200次，分辨率为4 cm-1。

1.2.4 香蕉茎秆单宁酸抗氧化活性的测定 DPPH是性质较为稳定的自由基，通常以此体系进行相关化合物与混合物的抗氧化能力的评价[7]。本试验用DPPH法测定了香蕉茎秆单宁酸的自由基清除能力。分别配置浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的香蕉茎秆单宁酸样品溶液，量取不同质量浓度的样品溶液2 mL，加入4 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH的乙醇溶液中。用力振荡混匀后置于暗室中静置30 min，于517 nm出测定吸光度AX，按照下式计算DPPH自由基清除率：

R/%=（1-）×100 （1）

空白为蒸馏水。式中：R表示DPPH自由基清除率，%；AX为加入样品溶液和DPPH自由基后的吸光度；AXO为2.0 mL样品溶液+4.0 mL无水乙醇的吸光度；AO为4.0 mL DPPH溶液+2.0 mL 50%乙醇的吸光度。

2 结果与分析

2.1 香蕉茎秆单宁酸提取工艺条件优化

2.1.1 提取时间对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响

在一定的时间范围内考察提取时间对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响，提取时间短则提取不充分，时间过长提取效率低，还可能导致提取量的下降。本试验主要探讨在0.5～2.5 h之间对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响。在提取温度45 ℃、料液比为1 ∶ 10时、乙醇浓度为50%进行试验。由图2可看出，在30～90 min之间提取量随着时间的延长而增加，当提取时间超过90 min，随时间延长提取量减少。原因可能是香蕉茎秆单宁酸变性所致[8]。因此提取时间为90 min较为适宜，提取量为13.03 mg/g。

2.1.2 提取温度对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响

温度升高有利于单宁酸的提取，原因是乙醇渗入到原料内打开单宁酸-蛋白质的连接键，使单宁酸的提取率提高[8]；但温度过高会加速氧化多酚物质，同时原料中的果胶、色素等其他物质也会更多地析出。本试验主要探讨提取温度在30～55 ℃之间对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响。试验条件为料液比1 ∶ 10，乙醇浓度40%，提取时间90 min。由图3可知，在30～45 ℃时，随温度增加，香蕉茎秆单宁酸提取量略微增加；当温度达到45 ℃时提取量最高。原因可能是温度升高，分子运动加速，氢键更易断裂，单宁酸的渗透、溶解、扩散速度也加快，使得单宁酸更易于从原料中溶出，提取量增加[9]。而当提取温度在50～55 ℃时，单宁酸提取量下降，这是由于温度较高单宁酸易于发生氧化或降解反应[10]。所以选择提取温度为45 ℃较为适宜。

2.1.3 乙醇浓度对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响

单宁酸具有多酚羟基结构，有一定极性，水、低碳醇、乙酸乙酯、丙酮都可作为溶剂。乙醇选择性好，对酚类物质有较好的溶解性，且无毒、价格低廉。本试验选择乙醇作为提取剂。在料液比为1 ∶ 12、提取温度50 ℃、提取时间90 min的条件下，改变乙醇浓度，考察其对香蕉茎秆中单宁酸提取量的影响。由图4可知，当乙醇浓度为40%，单宁酸提取量较低，仅为7.21 mg/g；当乙醇浓度为50%时，提取量最高，达到10.88 mg/g。当乙醇浓度继续增加，单宁酸提取量逐渐下降，原因可能是乙醇含量过高造成醇解反应，使多酚分子降解，单宁酸提取量降低。

2.1.4 料液比对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响

料液比的上升会增加单宁酸的溶出量[11]。当料液比过低时单宁酸提取不充分，导致提取量低，当料液比过高时容易造成溶剂的浪费。本试验主要探讨料液比为1 ∶ 5～1 ∶ 15之间对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响。在乙醇浓度50%、提取温度40 ℃、提取时间90 min的条件下，改变料液比，进行香蕉茎秆单宁酸的提取试验。由图5可知，随液料比的上升单宁酸提取量增加，当料液比为1 ∶ 12时，单宁提取量最高为12.53 mg/g。而当液料比继续增加，提取量也无明显增加。因此选择料液比为1 ∶ 12。

2.1.5 香蕉茎秆单宁酸提取工艺正交试验 正交试验结果和极差分析见表2。由表2中R值的大小可知，影响香蕉茎秆单宁酸提取量的各因素的主次关系为A>C>B>D，即乙醇浓度对香蕉茎秆单宁酸提取量的影响最大，其次为提取时间及料液比，最后是提取温度。正交试验的9种组合中，4号试验香蕉茎秆单宁酸含量最高，达到17.9 mg/g，相应的提取方案为A2B1C2D3，即乙醇浓度50%，提取时间90 min，料液比1 ∶ 11，提取温度50 ℃。这个组合是正交试验当前最好的水平搭配。

2.2 香蕉茎秆单宁酸纯化工艺优选

2.2.1 上样液流速对树脂吸附量的影响 上样液流速是多酚类物质有效分离的关键因素之一，对树脂吸附量有很大的影响。上样液流速过慢，耗费时间长，分离效率低；而上样液流速过快，单宁酸与树脂未充分接触发生吸附，便通过层析柱而流出柱外，达不到吸附效果[12]。由图6可知，流速越快，未被吸附量越高，吸附量就越少，因此上样液流速选择1.5 mL/min较为适宜。

2.2.2 上样液单宁酸浓度对树脂吸附量的影响

将预处理过的AB-8大孔吸附树脂柱装配好，上样前用超纯水平衡至柱层面稳定。当上样液流速一定，上样液单宁酸浓度增加，单宁酸吸附量增大，而且达到饱和吸附的时间短。所以提高上样液单宁酸浓度，有利于充分利用树脂，但是不能过高，否则杂质、沉淀、液体粘性会影响单宁酸在树脂表面的扩散，容易造成吸附量下降，不利于分离[13]。由图7可知，上样液浓度较低时，树脂的未被吸附量随上样浓度的增加而逐渐增多。当上样液浓度达到4 mg/mL后，随着浓度的增加，树脂未被吸附量未出现明显的增长，表明树脂中的活性吸附位点已经大大减少，树脂吸附渐渐达到饱和。当上样液浓度再增加到6 mg/mL，未被吸附的单宁酸量陡然上升，因此应该将上样液浓度控制在5 mg/mL。

2.2.3 洗脱液浓度对树脂洗脱量的影响 单宁酸经AB-8大孔树脂吸附后，需用选用合适的洗脱剂将其从树脂上洗脱下来才能达到分离纯化的目的[12]。洗脱剂的选择是能溶解吸附物质，沸点低能够易于蒸馏回收。由于AB-8大孔树脂为弱极性物质，所以必须选择极性较大的溶剂作为洗脱液。综合以上因素及考虑安全环保，本试验采用不同浓度的乙醇溶液作为洗脱液考察对树脂洗脱量的影响。由图8可知，在乙醇浓度为20%～60%的范围内，随着乙醇浓度的增加，单宁酸的洗脱量逐渐增加。当乙醇浓度继续增加，单宁酸洗脱量变化不大，无水乙醇的洗脱量为33.11 mg。由于香蕉茎秆单宁酸与树脂间存在氢键作用，吸附在树脂上的多酚类成分不容易被低浓度的乙醇洗脱下来。考虑乙醇用量等方面的因素，选择乙醇浓度为60%。

2.3 香蕉茎秆单宁酸性质的测定

2.3.1 相对分子质量测定 经较佳提取纯化工艺得到的香蕉茎秆单宁酸产物为深红褐色，表面带金属光泽，吸水性极强[11]。凝胶渗透色谱是按溶质分子的大小进行分离的一种色谱技术。通过多孔性凝胶固定相，使得样品中的大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来[14]。利用凝胶渗透色谱法（GPC）可以确定含有低聚物以及高度聚合的多酚成分样品的相对分子质量及分布，重均分子量，数均分子量等数据[15]。通过分析图9、10可知，所提取的香蕉茎秆单宁酸产物Z均相对分子质量为44 300.9，重均相对分子质量（Mw）为38 829.6，数均相对分子质量（Mn）为34 354.5。香蕉茎秆单宁酸分子质量在3.43×104～4.43×104之间，柿子单宁酸分子质量在1.16×104～1.54×104之间[16]。

2.3.2 FTIR分析 香蕉茎秆单宁酸FT-IR谱图见11。由图11可见，波数3 423 cm-1的谱峰为酚类分子-OH的伸缩振动。波数2 929 cm-1处有一中强吸收峰，是香蕉茎秆单宁酸提取物中的亚甲基-CH2的不对称伸缩振动；在1 629 cm-1处有一强吸收峰，C=C键伸缩振动在1 680～1 620 cm-1，是酚类分子苯环的骨架伸缩振动吸收峰[17]。1 384 cm-1是来自酚羟基-OH弯曲振动。芳族和乙烯基的=C-O-C反对称伸缩振动在1 275～1 200 cm-1处，对称伸缩振动在1 075～1 020 cm-1处，图11中出现1 208 cm-1，

1 061 cm-1均在上述两个区间。波数766 cm-1处有一较弱吸收峰，为芳环结构1，2取代。FTIR结果表明香蕉茎秆单宁酸提取物为多羟基苯酚酯类化合物。

2.4 香蕉茎秆单宁酸纯化物抗氧化特性

单宁酸邻苯三酚结构中有大量的邻位酚羟基，是优良的氢给予体，在有充足水分、相应酶和较高pH值的条件下，消耗周围环境中的氧气，聚合形成醌类结构[10]。DPPH是一种较为稳定的以氮为中心的自由基，它具有3个芳环结构，属于芳香类自由基。研究抗氧剂样品直接捕获或与自由基相结合的行为，可以大致推测抗氧化剂对芳香自由基的清除能力。由于自由基化学性质稳定，不易被清除，若受试物能够清除它，则表示受试物具有较强的自由基清除能力[18]。从图12可知，随着香蕉茎秆单宁酸样品浓度的增大，DPPH自由基清除能力整体呈上升趋势。当单宁酸浓度达到0.6 mg/mL时，DPPH自由基清除率为86.59%。由此可知，香蕉茎秆单宁酸对DPPH自由基有较强的清除能力。

3 讨论与结论

3.1 香蕉茎秆单宁酸的提取纯化工艺

香蕉茎秆作为一种丰富的生物质废弃物资源尚未得到有效开发和利用。目前国内外对香蕉茎秆的利用主要是提取纤维，而对提取香蕉茎秆单宁酸的研究较少。在中国，香蕉茎秆有药用的传统，在现代医学中香蕉茎秆用来防治脑溢血、高血压等疾病，其功效可能与香蕉茎秆所含丰富的有效成分有关[19]。李子建[7]以丙酮作为溶剂，采用正交试验优化香蕉茎秆单宁酸提取工艺，最佳工艺参数为：温度60 ℃，时间10 h，丙酮浓度100%，料液比1 ∶ 10，在此条件下香蕉茎秆单宁酸的提取率为5.13%。Nataraj等[20]采用不同溶剂提取香蕉茎秆中的多酚成分并研究其抗氧化活性。Kandasamy等[21]提出香蕉茎秆的汁液含有多种有效成分，并对其制备功能性饮料进行研究。任雪峰等人以香蕉皮为原料，蒸馏水为提取剂，采用响应面法优化提取工艺，单宁酸最佳提取工艺条件为：料液比1 ∶ 60.33 g/mL，温度51.71 ℃，时间1.49 h，在此条件下，单宁酸提取率为1.485%[22]。赵立利用正交试验对香蕉皮中单宁酸的最佳提取工艺进行优化，以丙酮-水体系为提取液，确定最佳工艺参数条件为：料液比1 ∶ 14 g/mL，提取温度60 ℃，提取时间10 h，总均提取率仅在0.588%左右[23]。本试验以香蕉茎秆为原料，选择乙醇为提取溶剂对单宁酸的提取工艺进行研究。考察料液比、加热温度、提取时间、乙醇浓度4个因素对单宁酸提取量的影响，从正交试验优化及极差分析得出，香蕉茎秆单宁酸提取影响因子的影响大小为乙醇浓度>提取时间>料液比>提取温度。香蕉茎秆单宁酸最佳提取工艺条件为：乙醇浓度50%，提取时间90 min，料液比1 ∶ 11 g/mL，提取温度50 ℃，在此条件下，香蕉茎秆单宁酸的提取量为17.9 mg/g。较佳纯化工艺条件为：5 mg/mL上样，流速为1.5 mL/min过AB-8型大孔树脂柱，最后用浓度为60%的乙醇洗脱。

3.2 香蕉茎秆单宁酸的表征及其抗氧化性

通过凝胶渗透色谱法得到香蕉茎秆单宁酸纯化物Z均相对分子质量为44 300.9，重均相对分子质量（Mw）为38 829.6，数均相对分子质量（Mn）为34 354.5。傅立叶红外光谱分析结果表明香蕉茎秆单宁酸具有多酚羟基结构，属于多羟基酚酯类化合物。植物多酚类化合物具有很高的生物活性，拥有极强的抗氧化和抑菌能力[24]。本试验结果表明，香蕉茎秆单宁酸纯化物在含量为0.6 mg/mL时对DPPH自由基清除率为86.59%，这说明香蕉茎秆单宁酸对DPPH有较强的清除能力。

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