DEHP胁迫对高/低累积邻苯二甲酸酯品种水稻抗氧化酶系统的影响

陈意良 鲁磊安 莫测辉 蔡全英

摘 要 以前期筛选获得的邻苯二甲酸酯（PAEs）高/低累积基因型水稻（Oryza sativa L.）品种（培杂泰丰/丰优丝苗）进行土培试验，对比研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）污染胁迫下2个品种水稻体内过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性及丙二醛（MDA）含量变化，以揭示DEHP胁迫下2个品种的生理生化和DEHP累积差异。结果显示，2个品种水稻体内DEHP含量随土壤污染浓度增加而增加，但生物量下降，而且培杂泰丰地上部的生物量敏感性响应指数和DEHP含量比丰优丝苗的高，说明前者对DEHP的耐受性更强。2个品种水稻体内丙二醛含量基本保持不变，但过氧化物酶和多酚氧化酶活性则随土壤DEHP浓度的增加而升高，说明水稻可能通过提高过氧化物酶和多酚氧化酶活性以降低DEHP胁迫。丰优丝苗的多酚氧化酶活性较培杂泰丰的高，可能影响到DEHP在水稻体内降解进而导致前者体内DEHP含量较低。

关键词 邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；水稻；多酚氧化酶；过氧化物酶；丙二醛

中图分类号 S511；X173 文献标识码 A

Abstract Two different genotypic cultivars of rice（Oryza sativa L.）with PAE（phthalic acid esters）high-accumulation（cultivar Peizataifeng）and low-accumulation（cultivar Fengyousimiao）were grown in soil spiked with di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP， 0， 50， and 100 mg/kg）. The peroxidase（POD）and polyphenol oxidase（PPO）activities， malondialdehyde（MDA）content were measured to reveal the difference in DEHP accumulation， physiology and biochemistry changes between Peizataifeng and Fengyousimiao. The results indicated that DEHP concentrations in rice plants increased while the biomass of rice decreased with increasing concentrations of DEHP in the soil. The index of biomass response to stress of Peizataifeng was higher than that of Fengyousimiao， indicating that Peizataifeng was more tolerant to DEHP than Fengyousimiao. The MDA contents of the two cultivars kept unchanged while the activities of PPO and POD increased with increasing concentrations of DEHP in the soil. These results illustrated that the rice might alleviate DEHP stress by elevating the activities of PPO and POD. The PPO activity of Fengyousimiao was higher than that of Peizataifeng， which might affect the in-vivo degradation of DEHP， and thus led to a lower DEHP concentration in Fengyousimiao than Peizataifeng.

Key words Di（2-ethylhexyl）phthalate； Rice； Peroxidase； Polyphenol oxidase； Malondialdehyde

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.007

随着农业生产中地膜覆盖和塑料大棚的广泛应用，2014年中国农用塑料薄膜使用量达258万t（地膜使用量为144万t）[1]，约20%的地膜残留在土壤中[2]。其中，邻苯二甲酸酯（PAEs，俗称塑化剂）在塑料中含量可达40%～60%[3]，地膜残留，加上大量施用化肥农药及“三废”污染，导致土壤PAEs含量上升。有研究发现，全国农业土壤PAEs含量以广东最高，部分高达几个到几十个mg/kg[4-5]。而且广东地区不同类型农业土壤中PAEs含量以水田的最高，其中以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）检出最普遍且含量最高[6]。PAEs尤其是长链的DEHP属于典型的环境内分泌干扰物，DEHP具有潜在“三致”毒性，被美国环保局（USEPA）列为“优控污染物”。

残留在土壤中的DEHP会通过根系吸收进入植物体内，影响植物生长及生理生化功能[7-8]。作者前期研究结果表明，低浓度DEHP处理会促进大部分品种菜心生长（生物量增加），而高浓度处理则有明显的抑制作用[8]。植物体内的生理生化过程是植物吸收累积外源污染物的内在调节因素[9]，特别是植物体内的酶系统对植物应对污染物胁迫的能力至关重要。其中，多酚氧化酶（PPO）被认为在植物体内可降解环状化合物[10]，是与植物体内防御系统有关的重要蛋白质[11]。植物会提高体内PPO活性来应对受到的生物或者非生物性胁迫[12-13]。有研究发现，PAEs胁迫下植物体内会产生大量的活性氧自由基，可能会导致脂质过氧化和酶失活等[14]。丙二醛作为细胞内膜脂过氧化或脱脂的产物，其含量的多少可以代表膜损伤程度的大小。过氧化物酶（POD）是一种重要的保护酶，能清除植物体内多余的活性氧自由基，抑制膜脂的过氧化进程[15]，从而保护植物生理活动的正常进行以应对外源污染物的胁迫。

外源污染胁迫下不同植物体内酶系统的反应不一样，进而影响到污染物对植物的毒理效应以及污染物在体内的降解，最终表现为不同植物对污染物的吸收累积差异[8，16]。作者前期研究发现，不同品种水稻对DEHP的吸收累积存在差异[16]，其根系形态和根系分泌物等也存在品种差异[17]。但DEHP胁迫下不同品种水稻的酶活性变化尚未清楚。本研究以前期筛选获得的高/低累积PAEs水稻品种培杂泰丰和丰优丝苗为供试植物[17]，研究DEHP污染胁迫下2种水稻体内的多酚氧化酶、过氧化物酶活性以及丙二醛含量的变化规律，为揭示其累积差异机理和保障农产品安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DEHP（AR）购自阿拉丁（上海公司）。培杂泰丰种子购自华南农业大学，丰优丝苗种子购自广东省农业科学研究院。水稻土取自华南农业大学试验农场田间0～20 cm的耕作层，采集后于室内风干、粉碎过5 mm筛备用。水稻土DEHP背景值0.71 mg/kg，pH5.59，有机质30.2 g/kg，CEC 7.67 cmol/kg，全氮1.26 g/kg、全磷1.79 g/kg和全钾18.0 g/kg，粒径组成：砂粒52.0%，粉粒41.9%，粘粒6.1%。

1.2 方法

1.2.1 盆栽试验方法 采用培杂泰丰（PAEs高累积）和丰优丝苗（PAEs低累积）进行土壤培养试验。设置空白、低浓度、高浓度3个处理。采用人工配制污染土壤，即量取一定量的DEHP溶于丙酮（AR），添加到水稻土（过1 mm筛）中，混匀，放置暗处让丙酮自然挥发3 d（中途不断搅拌使丙酮尽快挥发），制得DEHP含量为500 mg/kg和1 000 mg/kg的污染土壤。按污染土壤与未污染土壤1 ∶ 9的比例进行搅拌混匀，制得盆栽污染土壤（DEHP含量为50 mg/kg（低浓度）和100 mg/kg（高浓度）。以不添加DEHP的土壤为对照处理（CK）。每个处理3个重复，采用随机排列。

将丰优丝苗和培杂泰丰2个品种的种子分别用15%的过氧化氢消毒10 min，然后将消毒过的种子转移到培养皿中，置于生化培养箱中催芽24 h。将催芽后的种子撒在铺满基质的育苗板上，待水稻苗长至4～5片叶子时进行移苗。移苗后，每天浇水保持土壤呈淹水状态，并不定期添加营养液保证水稻正常生长。待长到45 d的时候，采集水稻根系和地上部样品。分别测定生物量、DEHP含量、过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性及丙二醛含量。

1.2.2 DEHP含量测定 植物样品采用二氯甲烷（色谱纯）超声提取，方法参考 USEPA 3500b[16]并适当修改。准确称量粉碎后的植物样品（地上部1.0 g，地下部0.5 g）于50 mL玻璃离心管中。加入20 mL二氯甲烷超声提取10 min，3 300 r/min离心分离（重复3次），将上述上清液合并后过硅胶柱净化，旋转蒸发仪（亚荣RE-52A，上海）浓缩，氮吹仪吹干后定容，4 ℃保存待测。待测液中DEHP采用气相色谱-质谱仪联机（GC-MS）分析，参考 USEPA 8270C 方法[17]并适当修改。GC-MS 联用仪型号为 GC-MSQP2010（岛津，日本），色谱柱为Rxi-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He）。质谱仪采用电子轰击源（EI）。采用 DEHP 化合物标样的0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L为工作曲线。DEHP回收率为88.03%～100.3%。水稻体内DEHP含量以干重计。

1.2.3 植物酶活性的测定 采用分光光度法测定PPO、POD活性和MDA含量，具体的测定方法参照Ma等[18]的方法。

1.3 统计分析方法

采用Excel进行数据整理及制图，SPSS进行统计分析。

为了比较培杂泰丰和丰优丝苗对PAEs污染胁迫的反应，按照下列公式计算生物量敏感性响应指数（BRS）[19]：

BRS/%=（BH-BL）/BL×100 BH（g）、BL（g）分别是高浓度处理和低浓度处理的生物量。

2 结果与分析

2.1 DEHP胁迫对水稻生物量的影响

由图1可以看出，培杂泰丰和丰优丝苗的地上部和地下部的生物量均随着DEHP浓度的增大而减小，说明50 mg/kg DEHP会抑制2种水稻的生长。而且，培杂泰丰地上部的生物量敏感性响应指数比丰优丝苗大，且差异显著（p<0.05）（表1），说明丰优丝苗对DEHP胁迫比培杂泰丰更为敏感。

2.2 水稻体中DEHP含量

随着DEHP浓度的升高，培杂泰丰和丰优丝苗的地上部和地下部DEHP的含量均增加，且不同处理水平之间差异极显著（表2），说明水稻体对DEHP有累积效应。但2个品种水稻地上部的DEHP含量比同等污染水平下（100 mg/kg）的菜心地上部DEHP含量显著低[8]，说明水稻地上部较菜心累积DEHP少。同一处理地下部与地上部相比，前者DEHP含量较高，即DEHP在水稻体内的转运系数小于1，说明DEHP更易被根系累积或滞留。经双因素方差分析，品种间地上部DEHP含量差异显著，地下部无显著差异（表2），验证了培杂泰丰和丰优丝苗分别是高、低累积DEHP的水稻品种。

2.3 水稻体酶活性

2.3.1 过氧化物酶活性 过氧化物酶（POD）是植物抗氧化酶系统中的一种重要保护酶，能清除机体内活性氧自由基，有利于植物维持体内活性氧产生和淬灭的动态平衡，从而抑制膜脂过氧化的进程。如图2所示，培杂泰丰和丰优丝苗地上部的POD活性均随着DEHP浓度的升高而升高。经双因素方差分析表明（表3），培杂泰丰和丰优丝苗2个品种的多酚氧化酶活性无显著差异，但二者地上部的DEHP含量差异极显著，这说明不同品种水稻对DEHP胁迫产生应激反应的阈值不同，培杂泰丰比丰优丝苗更耐受DEHP胁迫。

2.3.2 多酚氧化酶活性 多酚氧化酶（PPO）是一种存在于多种真菌和植物组织内、能够促进酚类化合物氧化的一类酶的通称[20]。图3可知，随着土壤DEHP浓度的升高，PPO活性整体呈上升趋势，与植物中DEHP含量变化规律一致（表1）。说明高浓度DEHP处理会激活PPO，从而保护植物不受DEHP毒害。经双因素方差分析可知（表3），不同浓度、不同品种之间PPO活性差异极显著。

2.3.3 丙二醛含量 植物受到外源污染物入侵时，会产生大量的活性氧自由基，其易使植物细胞内膜发生过氧化作用或脱脂作用，丙二醛（MDA）作为细胞内膜脂过氧化或脱脂的产物，其含量的多少可以代表膜损伤程度的大小[15]。由图4可以看到，低DEHP处理培杂泰丰的MDA含量显著高于其对照，浓度增加后MDA含量下降；而丰优丝苗各处理间MDA含量无显著差异。

3 讨论与结论

3.1 讨论

生物量被认为是植物受到污染物毒害最好的指示物[21]。污染物对植物生物量的影响与其浓度、植物种类以及生长期等有关[22]。有研究发现，低浓度DEHP或DBP处理促进植物生长，高浓度则抑制生长[8，13]。本研究中DEHP处理的生物量均比空白对照的低，说明DEHP胁迫抑制水稻生长。当植物受到DEHP胁迫时，会激发植物自身的防御体系，诱导POD活性增大以应对DEHP胁迫导致的体内氧自由基增加。类似的，有研究发现DBP和DEHP胁迫下绿豆POD活性随着污染物浓度的增大而呈现上升趋势，但达到最大值后，随污染物浓度增大POD活性降低。这可能由于高浓度污染下产生的自由基数量超出了POD的清除能力而对植物造成伤害[13，23]。这说明POD活性存在一个阈值，对植物的保护作用存在一定的限度。本研究中POD活性一直保持上升的趋势，可能是因为本研究水稻体内DEHP产生的自由基数量尚未超出POD的清除能力。

当植物吸收外源污染物后，体内的一些特定酶如酚氧化酶、氧化物酶、P450单加氧酶等，能对体内的外源污染物进行转化/代谢[24-25]。例如，Gong等[26]研究发现，PPO主导了高羊茅（Festuca Arundinacea）体内多环芳烃的降解。本研究中，低浓度DEHP处理下培杂泰丰的PPO活性与对照间差异不显著，而丰优丝苗的PPO活性显著高于其对照，这可能是因为不同品种水稻对DEHP胁迫产生应激反应不同[22]。同一DEHP水平下，丰优丝苗的PPO活性显著高于培杂泰丰的，可能影响水稻体内DEHP的降解进而导致前者体内DEHP含量较低。

2个品种水稻体内丙二醛含量基本保持不变（图4），但其过氧化物酶和多酚氧化酶活性则随DEHP浓度的增加而升高。这可能是因为水稻受到DEHP胁迫导致其体内活性氧自由基增加，地上部出现应激防御，提高POD和PPO活性，及时清除植物体内多余的活性氧自由基并降解DEHP，从而使MDA含量保持稳定，但具体原因有待进一步深入研究。

3.2 结论

DEHP胁迫下，培杂泰丰和丰优丝苗生物量均随着DEHP浓度的升高而降低，说明50 mg/kg DEHP会抑制2种水稻的生长。培杂泰丰和丰优丝苗体内的DEHP含量均随着DEHP浓度的升高而升高，说明2种水稻对DEHP均有累积效应，且DEHP更易被根系累积或滞留。

DEHP胁迫下，培杂泰丰和丰优丝苗体内的MDA含量基本保持不变，但POD和PPO活性均升高。丰优丝苗和培杂泰丰的POD和PPO活性变化规律不同，前者的POD活性比后者的高，可能影响到DEHP在水稻体内降解进而导致前者体内DEHP含量较低。

参考文献

[1] 国家统计局农村社会经济调查司. 中国农村统计年鉴[M]. 北京： 中国统计出版社， 2015： 41.

[2] 中国环境保护部. 第一次全国污染源普查公报[R]. 2010： 10.

[3] Mo C H， Cai Q Y， Zeng Q Y. Occurrence of priority organic pollutants in the fertilizers， China[J]. Journal of Hazardous Materials， 2008， 152（3）： 1 208-1 213.

[4] Cai Q Y， Mo C H， Wu Q T， et al. The status of soil contamination by semivolatile organic chemicals（SVOCs）in China： A review[J]. Science of the Total Environment， 2008， 389（2-3）： 209-224.

[5] Niu L L， Xu Y， Xu C， et al. Status of phthalate esters contamination in agricultural soils across China and associated health risks[J]. Environmental Pollution， 2014， 195： 16-23.

[6] 杨国义， 张天彬， 高淑涛， 等. 广东省典型区域农业土壤中邻苯二甲酸酯的分布特征[J]. 应用生态学报， 2007， 18（10）： 2 308-2 312.

[7] Zhao H M， Du H， Xiang L， et al. Physiological differences in response to di-n-butyl phthalate（DBP）exposure between low- and high-DBP accumulating cultivars of Chinese flowering cabbage （Brassica parachinensis L.）[J]. Environmental Pollution， 2016， 208： 840-849.

[8] Zhao H M， Du H， Xiang L， et al. Variations in phthalate ester （PAE）accumulation and their formation mechanism in Chinese flowering cabbage（Brassica parachinensis L.）cultivars grown on PAE-contaminated soils[J]. Environmental Pollution， 2015， 206： 95-103.

[9] Ma T T， Christie P， Luo Y M， et al. Physiological and antioxidant responses of germinating Mung Bean seedlings to phthalate esters in soil[J]. Pedosphere， 2014， 24（1）： 107-115.

[9] Mostofa M G， Hossain M A， Fujita M， et al. Physiological and biochemical mechanisms associated with trehalose-induced copper-stress tolerance in rice[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 11 433.

[10] Edwards W， Bownes R， Leukes W D， et al. A capillary membrane bioreactor using immobilized polyphenol oxidase for the removal of phenols from industrial effluents[J]. Enzyme and Microbial Technology， 1999， 24： 209-217.

[11] Constabel C P， Bergey D R， Ryan C A. System in activates synthesis of wound-inducible tomato leaf polyphenol oxidase via the octadecanoid defense signaling pathway[J]. PNAS， 1995， 92： 407-411.

[12] Kwak S S， Kim S K， Park I H， et al. Enhancement of peroxidase activity by stressed-related chemicals in sweet potato[J]. Phytochemical Analysis， 1996， 43： 565-568.

[13] Ma T T， Christie P， Teng Y， et al. Rape（Brassica chinensis L.）seed germination， seedling growth， and physiology in soil polluted with di-n-butyl phthalate and bis（2-ethylhexyl）phthalate[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2013， 20： 5 289-5 298.

[14] Winston G W. Oxidants and antioxidants in aquatic animals[J]. Comparative Biochemistry and Physiology， 1991， 100： 173-176.

[15] 严重玲， 洪业汤， 付舜珍， 等. Cd、Pb胁迫对烟草叶片中活性氧清除系统的影响[J]. 生态学报， 1997， 17（5）： 488-492.

[16] Cai Q Y， Xiao P Y， Chen T， et al. Genotypic variation in the uptake， accumulation， and translocation of of di-（2-ethylhexyl） phthalate by twenty cultivars of rice（Oryza sativa L.）[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2015， 116： 50-58.

[17] 陈桐， 蔡全英， 吴启堂， 等. PAEs胁迫对高/低累积品种水稻根系形态及根系分泌低分子有机酸的影响[J]. 生态环境学报， 2015， 24（3）： 494-500.

[18] Ma T T， Christie P， Luo Y M， et al. Physiological and antioxidant responses of germinating Mung Bean seedlings to phthalate esters in soil[J]. Pedosphere， 2014， 24（1）： 107-115.

[19] Wang J， Yuan J， Yang Z， et al. Variation in cadmium accumulation among 30 cultivars and cadmium subcellular distribution in 2 selected cultivars of water spinach（Ipomoea aquatica Forsk.）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009， 57： 8 942-8 949.

[20] John K S， Bhat S G， Rao UJSP， et al. Isolation and partial characterization of phenol oxidases from Mangifera indica L. sap（latex）[J]. Journal of molecular catalysis B-enzymatic， 2011， 68： 30-36.

[21] Shi G R， Cai Q S. Cadmium tolerance and accumulation in eight potential energy crops[J]. Biotechnology Advances， 2009， 27： 555-561.

[22] Xin J， Huang B， Liu A， et al. Identification of hot pepper cultivars containing low Cd levels after growing on contaminated soil： uptake and redistribution to the edible plant parts[J]. Plant soil， 2013， 373： 415-425.

[23] Liu W L， Zhang C B ， Liu S Y. Effects of phthalate ester treatment on seed germination and antioxidant enzyme activities of Phaseolus radiatus L[J]. Bulletin of Environment Contamination and Toxicology， 2014， 92： 621-624.

[24] Kvesitadze E， Sadunishvili T， Kvesitadze G. Mechanisms of organic contaminant uptake and degradation in plants[J]. World Acad Sci Eng Technol， 2009， 55： 458-468.

[25] Schroder P. Phytoremediation： Methods and reviews[M]. Totowa： Humana Press， 2007： 251-263.

[26] Gong S S， Han J， Gao Y Z， et al. Effects of inhibitor and safener on enzyme activity and phenanthrene metabolism in root of tall fescue[J]. Acta Ecologica Sinica， 2011， 31： 4 027-4 033.