HPLC法测定梨果肉中的熊果苷和绿原酸



HPLC法测定梨果肉中的熊果苷和绿原酸

摘要：本文采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定梨肉中熊果苷和绿原酸的含量。采用W ondasil-C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）为固定相，甲醇：磷酸水（pH 2.5）=25：75（V/V）为流动相，流速0.6m l/min，在280 nm、柱温30℃下进行检测。本法中熊果苷、绿原酸分别在0.0002～0.01mg/m l、0.001～0.05mg/m l浓度范围内呈线性关系，其相关系数分别为0.9987、0.9994，相对标准偏差分别为2.88%、1.04%，标准加入回收率分别为99.2%、99.6%。该方法操作简单，准确度高，整个试验的精密度和回收率良好，可用于梨果肉中熊果苷、绿原酸的快速检测。

关键词：梨果肉；熊果苷；绿原酸；高效液相色谱法

熊果苷和绿原酸是梨果实中最具代表性的活性成分。熊果苷又名熊果素，是源于绿色植物的天然活性物质，能够通过抑制体内络氨酸酶的形成来阻止黑色素的形成，是当今流行的最为安全的美白原料，也是理想的皮肤美白祛斑活性剂，主要用于高级化妆品的制备。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，有抗诱变、保肝利胆、抗菌抗病毒及解痉等作用，在药品、保健品、食品行业、化妆品行业的开发利用价值很大。因此，研究梨肉中的熊果苷和绿原酸有十分重要的作用和意义。

目前关于熊果苷和绿原酸的测定方法使用最多的就是高效液相色谱法，该方法操作简单，分析速度快，准确度高，可以同时测定多种酚类物质。本试验旨在进一步优化条件，更加准确、快速地测定梨果肉中熊果苷和绿原酸的含量。

1　材料与方法

1.1试验材料。雪梨、鸭梨购于邢台家乐园超市。

1.2试验药品。甲醇、乙腈、熊果苷、绿原酸为色谱纯；浓磷酸为分析纯；实验用水为超纯水。

1.3试验仪器。LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-M 20A二极管阵列检测器），日本岛津公司；FA2004电子天平，上海精密仪器公司；KQ-50B型超声波清洗器，天津市瑞普电子仪器公司；SC-3612低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C型数字式酸度计，江苏江分电分析仪器有限公司。

1.4标准溶液的配制。配制浓度为熊果苷0.01mg/m l、绿原酸0.05mg/m l标准溶液。

1.5梨肉样品的处理。准确取称取鸭梨果肉（去皮）10.2208 g，加入80%甲醇100m l，匀浆1min。取上清液20 m l，在4 000 r/m in的转速下，离心10m in，取上清液过0.45μm滤膜，进样10μl。

准确称取雪梨样品11.6410 g，按如上步骤制取雪梨样品。

1.6色谱条件。Wondasil-C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶磷酸水（pH2.5）=25∶75 （V/V），流速：0.60m l/m in，在波长280 nm、柱温为30℃条件下进行检测。

2　结果与讨论

2.1流动相的优化

2.1.1有机溶剂含量的选择。在其他条件保持不变的情况下，探究甲醇：水相（pH2.5）在四个不同比例（20∶80、25∶75、30∶70、40∶60）下熊果苷和绿原酸的色谱图（图1）。

图1　不同流动相比例标样分离色谱图注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；a、b、c、d甲醇∶水相（pH2.5）分别为20∶80、25∶75、30∶70、40∶60

分析图1和图2可得，随着有机相比例的增加，出峰时间越来越短，但是当流动相比例增加到30∶70、40∶60时，梨肉样品中熊果苷峰形明显不如25∶75时效果好，所以综合考虑，流动相比例选择25∶75。

图2　不同流动相比例梨肉样品分离色谱图注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；e、f、g甲醇：水相（pH2.5）分别为25∶75、30∶70、40∶60

2.1.2水相pH值的选择。pH值对出峰时间和峰形都有一定的影响。在其他条件不变的情况下，设置4个磷酸水溶液pH值（2.10、2.50、3.00、3.50）进行试验。分析图3可得知，pH值为3.50时绿原酸的保留时间太长，所以不选择。pH值为2.10、2.50和3.00时出峰时间相当，但pH值为2.10时，接近色谱柱的使用下限，所以不选择。

图3　不同pH值标样分离色谱图注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；h、i、j、k的pH值分别为2.10、2.50、3.00、3.50

结合图4得知，pH值为3.00时，两个梨肉样品中熊果苷的分离效果不及2.50时的好，所以pH值选择2.50作为试验条件。

图4　不同pH值梨肉样品色谱图的比较注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；l、m的pH值分别为2.50、3.00。

2.1.3温度的选择。其他条件保持不变，分别探究在室温22℃和30℃条件下熊果苷和绿原酸的出峰情况，见图5。30℃时，熊果苷和绿原酸的出峰时间早于22℃时的情况，因此温度选择30℃作为试验条件。

图5　不同温度的色谱图比较注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；n、o分别为22℃、30℃。

2.1.4流速的选择。保持其他条件不变，分别探究流速为0.6m l/m in和0.8m l/m in时熊果苷和绿原酸的分离情况，结果如图6所示。

图6　不同流速的色谱图比较注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；p、q分别为0.6、0.8m l/m in

由图6可知，流速为0.6m l/m in时，熊果苷和绿原酸的保留时间要比0.8m l/m in时的长，但综合考虑理论塔板数和分离度，流速为0.6m l/min时理论塔板数和分离度高于0.8m l/m in，所以流速选择0.6m l/m in作为试验条件。

表1　不同比例流动相中熊果苷和绿原酸的分离情况

2.2线性关系考察。用流动相逐级稀释混合标准液，配制成含熊果苷浓度（mg/m l）依次为0.0002、0.0001、0.0025、0.005、0.01的溶液，绿原酸浓度（mg/m l）依次为0.001、0.005、0.0125、0.025、0.05的溶液。进样10μl。以样品浓度c对峰面积A作图，见图7，熊果苷在0.0002～0.01mg/m l浓度范围内呈线性关系，其回归方程为：y=32475762.77 x+6590.85，相关系数R2=0.9987。绿原酸在0.001～0.05mg/m l浓度范围内呈线性关系，回归方程为：y=23136381.58 x+4241.06，相关系数R2= 0.9994。

图7　标准曲线图注：图中r、s分别为熊果苷、绿原酸

2.3精密度。取熊果苷和绿原酸的标准混合液10μl进样，连续测定3次，计算其相对标准偏差（RSD），见表2。由表2可知，研究对象相对标准偏差（RSD）分别为2.88、1.04，结果表明本试验的精密度良好。

表2　精密度测定结果（n=3）

2.4回收率。分别精确移取熊果苷和绿原酸标准试样，配制成1.5、3.0、4.5μg/m l熊果苷溶液，1.5、3.0、4.5μg/m l绿原酸溶液，三组试样，在色谱条件下（见1.6），分别进样10μl，根据所得峰面积用回归方程计算回收率及其相对标准偏差（RSD）。熊果苷、绿原酸的平均回收率分别为99.2%、99.6%，相对标准偏差分别为0.46%，0.33%。结果表明，本方法回收率较好，且两种互不干扰。

2.5样品测定。分别准确吸取在实验条件（1.5）下制得的雪梨、鸭梨样品溶液10μl，按色谱条件（1.6）进样。由图8可见，熊果苷和绿原酸两组分可以很好的分离、测定。计算得出雪梨梨肉中熊果苷含量为7.8667μg/g，绿原酸含量为210.9333μg/g；鸭梨梨肉中熊果苷含量为14.0667μg/g，绿原酸含量为88.2667μg/g。

图8　梨肉中熊果苷和绿原酸的测定注：1、2分别为熊果苷、绿原酸；r、s分别为鸭梨、雪梨

3　结论与展望

本文采用HPLC法同时测定了梨肉中熊果苷和绿原酸含量，经过探索分析，得到最优色谱条件：Wondasil-C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）为固定相；甲醇—水（25∶75，V/V）为流动相，水相是pH值为2.5的磷酸溶液，流速为0.6m l/m in，在波长280 nm、柱温30℃下进行检测。此方法操作简单，分析时间短，18m in内可完成测定，分离效果好，线性关系良好，精密度、回收率高，还可同时分离和测定梨果肉中的熊果苷和绿原酸，在梨果实活性成分研究和检测中有重要意义，也为医药保健、食品行业、化妆品行业中绿原酸、熊果苷的研究和检测打下了基础。

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