异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型肾上腺轴改变的研究

毛吾兰·买买提依明， 张盼盼， 景玉宏， 薛志琴， 阿地力江·伊明，陈胜国，刘凤霞

(新疆医科大学基础医学院1生物学教研室， 2人体解剖学教研室， 乌鲁木齐　830011； 3兰州大学基础医学院解剖学教研室， 兰州　730000)



异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型肾上腺轴改变的研究

毛吾兰·买买提依明1， 张盼盼2， 景玉宏3， 薛志琴2， 阿地力江·伊明2，陈胜国2，刘凤霞2

(新疆医科大学基础医学院1生物学教研室，2人体解剖学教研室， 乌鲁木齐830011；3兰州大学基础医学院解剖学教研室， 兰州730000)

摘要：目的研究异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型肾上腺轴相关激素与形态学改变，探讨其在该病证发生、发展中可能的机制。 方法100只SD大鼠经实验确认具有正常性功能后，选取其中10只作为正常组，其余90只作为造模组，采用湿寒性饲料和湿寒性环境条件下建立异常黏液质证候模型。造模20 w后，通过交配和勃起实验筛选出阳痿病证模型，并将其分为病证模型组和病证药物反证组，未成阳痿者为证候模型，分为证候模型组与证候药物反证组。药物干预2 w以后，检测各组大鼠外周血清中肾上腺轴相关激素水平，并观察下丘脑、垂体和肾上腺的形态学变化。 结果病证模型组肾上腺素较正常组有明显升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。病证模型组去甲肾上腺素较正常组显著升高(P<0.05)，经药物干预后，显著下调(P<0.05)，且与正常组差异无统计学意义(P>0.05)。证候模型组去甲肾上腺素亦较正常组明显升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。病证模型组醛固酮较正常组显著升高(P<0.05)，证候药物反证组亦显著高于正常组(P<0.05)，其它各组间差异无统计学意义(P>0.05)。形态学变化: (1)下丘脑： ①正常组：组织结构与细胞形态完好。②证候模型组：光镜下细胞基质较疏松，电镜下神经元核膜界线不清。③病证模型组：光镜下细胞基质疏松，呈网状结构，提示有水肿。电镜下细胞基质密度下降，线粒体呈空泡样变，糙面内质网轻度扩张。④证候药物反证组与病证药物反证组：组织病理学改变得到一定程度修复。 (2)垂体：①正常组：组织结构完好。②证候模型组：光镜下细胞基质疏松，电镜下线粒体呈空泡样变。③病证模型组：光镜下腺垂体基质疏松，细胞水肿；电镜下细胞间隙增大，糙面内质网扩张。④证候药物反证组与病证药物反证组：糙面内质网扩张减少，得到一定程度的修复。 (3)肾上腺：①正常组：组织结构正常。②证候模型组：光镜下血管扩张，电镜下基质密度下降。③病证模型组：光镜下轻度水肿，细胞体积增大，电镜下线粒体数量减少。④证候药物反证组与病证药物反证组：水肿减轻，线粒体数量有所上升。结论异常黏液质型阳痿病证大鼠模型肾上腺轴相关激素水平和形态学可发生改变，提示其可能参与该病证的发生、发展。

关键词：异常黏液质； 勃起功能障碍； 肾上腺轴

阳痿即阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是指性发育成熟后的成年男性因阴茎勃起功能减退或丧失，而不能完成满意性生活, 常常伴随有性欲减低与早泄等症状[1-2]。维吾尔医学(维医)对阳痿的认识具有悠久的历史，在上千年的医疗实践中，维吾尔医对阳痿的诊断和治疗模式不断成熟。目前，使用维药治疗阳痿是维吾尔医学男科诊疗的特色并具有一定的优势。

根据维医体液学说，胆液质、血液质、黏液质及黑胆质4种体液在体内形成一定的平衡状态，但是在内因和外因等各种条件的综合作用下，4种体液之间的相对平衡关系被破坏，就会产生某一种或多种体液的异常状态[3]。对于阳痿来说，可根据维医体液论分为异常黏液质型、异常血液质型、异常胆液质型和异常黑胆质型4 种证型的阳痿，其中异常黏液质型阳痿的发病率最高。维药伊木萨克片为异常黏液质型阳痿病证对证维药，具有补肾、壮阳、益精和固坚之功效[4]。本课题组前期研究根据维医体液论，采用湿寒性质的饲料和湿寒环境复合干预的方法建立了异常黏液质型阳痿病证大鼠模型，并开展了系列研究[5-8]。本研究在此基础上就异常黏液质型阳痿证候与病证大鼠模型肾上腺轴相关激素与形态学改变进行了进一步研究，旨在探讨肾上腺轴改变在该病证发生、发展中可能的内分泌机制。

1材料与方法

1.1实验动物选择经交配实验和勃起实验证实具有正常性功能的雄性SD大鼠100只和雌性大鼠20只，体质量(230±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2动物模型建立及分组在100只雄性SD大鼠中随机抽取10只作为正常对照组，其余90只SD大鼠为造模组。实验前适应性饲养1周，自由饮食水，12 h为1个周期昼夜交替饲养，饲养环境温度为(22±2 )℃ ，湿度为(55±5)% 。随后参照文献[7]建立证候模型，并筛选出阳痿病证模型后，将其随机分为病证模型组、病证药物反证组、证候模型组及证候药物反证组。特殊饲料由新疆医科大学实验动物中心制备，以每千克常规饲料中加入150 g芫荽实和菠菜实制成湿寒性特殊饲料。

1.3药物干预将药物反证组大鼠于常规条件下饲养并同时使用对证药物伊木萨克片每日灌胃1次(250 mg/ kg体质量)，其余各组大鼠则用等量的蒸馏水灌胃，干预2 w。期间记录各项生物学表征，进行APO勃起实验和性行为学实验并记录结果。

1.4标本制备与观察药物干预2 w后，将所有大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，行腹主动脉采血约10 mL，静置，离心，取上层血清，冻存备用。取各组大鼠下丘脑、垂体和肾上腺组织，一部分用戊二醛和锇酸双固定，其余部分用10%甲醛固定，并将其制成石蜡切片和超薄切片，分别进行HE 染色和铅铀染色等处理后，在光镜和透射电镜(JEM-1230，日本)下进行形态学观察。

1.5激素水平检测放免法检测各组大鼠外周血清中肾上腺轴相关激素水平，在新疆医科大学第一附属医院核医学放免实验室进行。

2结果

2.1肾上腺轴激素检测结果病证模型组肾上腺素(Epinephrine，EPI)虽较正常组明显升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，各组间差异无统计学意义(P>0.05)；病证模型组去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)较正常组显著升高(P<0.05)，并经药物干预后，显著下调(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。证候模型组NE虽较正常组明显升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。 与正常组比较，病证模型组醛固酮(Aldosterone, Ald )显著升高(P<0.05)，其他各组虽明显升高，但差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2肾上腺轴形态学观察结果2.2.1下丘脑(1)正常组：在光镜下，神经元形态结构完好，细胞核形态规则，界线清晰，胞浆较丰富。电镜下，神经胶质细胞基质密度均一，细胞核呈椭圆形，粗面内质网较发达。(2)证候模型组：基质较疏松，大部分细胞核深染均一；超微结构显示，神经胶质细胞基质密度下降较为明显，核周隙变宽，线粒体呈空泡样变，神经元核膜界线不清。(3)病证模型组：光镜下可见血管扩张并充血，细胞基质疏松，呈现出空泡状病变，提示有水肿。电镜下，神经胶质细胞基质密度下降较明显，细胞器较少且分散，线粒体水肿并呈空泡状病变，核周隙增宽，异染色质明显增多；神经元核膜界线不清，核内异染色质明显增多，线粒体嵴较散乱，且基质密度下降，糙面内质网扩张。(4)证候药物反证组：基质水肿明显减轻；电镜下神经胶质细胞基质密度均一，核型规则，神经元基质密度上升，异染色质仍较多，未见核仁。(5)病证药物反证组：光镜下可见基质水肿减轻，细胞核染色较淡。电镜下，神经胶质细胞基质密度有所升高，少数线粒体水肿呈空泡样变；神经元核膜清晰，核形规则(图1、2)。

表1　各组大鼠外周肾上腺轴激素水平检测(±s， ng/mL)

注：与正常组比较，*P<0.05； 与病证模型组比较，#P<0.05。

2.2.2垂体(1)正常组：光镜下，正常组腺垂体嗜酸性细胞呈圆形或椭圆形；神经垂体可见无髓神经纤维，其间分布有丰富的窦状毛细血管。电镜下细胞排列致密，胞核近似圆形，糙面内质网较发达并有较多分泌颗粒。(2)证候模型组：光镜下基质疏松程度较轻，细胞轻度水肿；超微结构可见细胞排列较为紧密，胞核及核仁未发现异常，胞质中分布有较多的分泌颗粒，内质网明显扩张。(3)病证模型组：光镜下细胞基质疏松明显，呈水肿样变，细胞核界线不清。电镜下细胞间隙明显增大，胞浆内出现大量分泌颗粒，线粒体呈空泡样变，糙面内质网扩张明显。(4)证候药物反证组：光镜下可见基质疏松明显改善。电镜下细胞排列紧密，核型规则，核周隙轻微增宽，少部分线粒体水肿。(5)病证药物反证组：光镜下细胞呈轻度水肿，基质疏松程度改善。电镜下细胞排列紧密，线粒体水肿和糙面内质网扩张程度明显改善(图1、2)。

A： 正常组下丘脑(×400)； B： 证候模型组下丘脑(×400)； C： 病证模型组下丘脑(×400)； D： 证候药物反证组下丘脑(×400)； E： 病证药物反证组下丘脑(×400)； F： 正常组垂体(×400)； G： 证候模型组垂体(×400)； H： 病证模型组垂体(×400)； I： 证候药物反证组垂体(×400)； J： 病证药物反证组垂体(×400)； K： 正常组肾上腺(×100)； L： 证候模型组肾上腺(×100)； M： 病证模型组肾上腺(×100)； N： 证候药物反证组肾上腺(×100); O： 病证药物反证组肾上腺(×100)。

图1各组大鼠肾上腺轴HE染色结果

A： 正常组下丘脑神经胶质细胞(×10 000)； B： 证候模型组下丘脑神经胶质细胞(×10 000)； C： 病证模型组下丘脑神经胶质细胞(×10 000)； D： 证候药物反证组下丘脑神经胶质细胞(×10 000)； E： 病证药物反证组下丘脑神经胶质细胞(×10 000)； F： 正常组下丘脑神经元(×8 000)； G： 证候模型组下丘脑神经元(×8 000)； H： 病证模型组下丘脑神经元(×8 000)； I： 证候药物反证组组下丘脑神经元(×8 000)； J： 病证药物反证组下丘脑神经元(×8 000)； K： 正常组垂体(×6 000)； L： 证候模型组垂体(×6 000)； M： 病证模型组垂体(×6 000)； N： 证候药物反证组垂体(×6 000)； O： 病证药物反证组垂体(×6 000); P： 正常组肾上腺(×8 000)； Q： 证候模型组肾上腺(×8 000)； R： 病证模型组肾上腺(×8 000)； S： 证候药物反证组肾上腺(×8 000); T： 病证药物反证组肾上腺(×8 000)。

图2各组大鼠肾上腺轴电镜结果

2.2.3肾上腺(1)正常组：光镜下结构正常；电镜显示肾上腺皮质细胞呈多边形，细胞内充满大小不一的脂滴，细胞质中线粒体多，呈球形，滑面内质网呈管泡状散在分布于线粒体之间。(2)证候模型组：光镜显示间质血管轻度充血扩张。超微结构显示细胞膜模糊，核膜界线不清，细胞基质密度下降，脂滴数量减少。(3)病证模型组：光镜下可见间质血管扩张充血明显，轻度水肿。电镜下细胞间隙增宽，脂质颗粒减少，线粒体数量减少，且基质密度降低。(4)证候药物反证组：细胞形态趋于正常。超微结构显示细胞基质密度有所上升，脂质颗粒数量增多。(5)病证药物反证组：光镜下间质血管扩张充血有所改善，球状带细胞核染色较深，水肿减轻。电镜下细胞基质密度有所上升，脂质颗粒数量增多(图1、2)。

3讨论

维吾尔医学是我国传统医学的重要组成部分。本课题组前期研究工作中，以维医阳痿的主要证型即异常黏液质型阳痿病证作为切入点，建立该病证动物模型，并结合对证维药伊木萨克片开展了系列研究[5-7]。在对该病证的生物学表征与相关信号传导通路展开系统性研究的基础上，对其性腺轴内分泌改变进行了研究与探讨[8-9]，发现该病证模型性腺轴功能发生显著改变，且形态学亦发生病理性变化。由此推断神经内分泌功能紊乱可能是该病证发生发展的核心机制之一。为此，本研究在此基础上对该病证肾上腺轴相关激素改变与组织病理学变化进行了进一步研究与探讨。

阴茎勃起实际上是血管与阴茎海绵体平滑肌舒张的生理学反应。血管舒张和收缩物质含量的变化发挥着重要作用。其中NE作为重要的收缩物质，通过RhoA/Rho激酶途径发挥着作用，促进平滑肌收缩[10]。而Ald作为盐皮质激素，主要调节肾脏对钠的重吸收和维持水平衡，但重要的是，醛固酮的分泌是通过肾素-血管紧张素系统实现的，高水平的醛固酮浓度不仅可预测代谢综合征，更可引起血管内皮功能障碍[11]。

本研究结果显示，阳痿病证模型大鼠NE及Ald 水平较正常组显著升高(P<0.05)，提示，肾上腺轴激素亦发生了紊乱，以及NE和Ald可能参与到了异常黏液质型阳痿病证的发生、发展过程，并通过增强血管收缩性发挥着关键性作用。病证模型经药物干预后，NE水平较病证模型组显著下调(P<0.05)，且与正常组间无显著性差异(P>0.05)。而Ald亦明显下调，且和正常组之间无显著性差异(P>0.05)，但和病证模型组之间差异亦无统计学意义(P>0.05)。该结果提示，伊木萨克片可通过调节肾上腺轴来发挥治疗作用。形态学观察发现，与正常组相比，下丘脑 、垂体和肾上腺组织细胞基质密度明显下降，有空泡样病变，线粒体基质密度下降，粗面内质网轻度扩张，该结果可能是肾上腺轴相关激素发生紊乱的组织病理学基础，经药物干预后上述组织学改变得到一定程度的修复。

综上所述，异常黏液质型阳痿病证的发生、发展可能与肾上腺轴相关激素和组织病理学改变密切相关，但其具体机制尚不完全清楚，肾上腺轴和性腺轴、甲状腺轴在该病证的发生、发展中的相互作用与关系更有待于进一步深入研究，以揭示该病证的发生发展的神经内分泌核心机制。

参考文献:

[1]中国医学百科全书编辑委员会，中国百科全书维吾尔医学分册[M].上海：上海科学技术出版社，2005：20-124.

[2]薛建国, 樊千，卢宗林.从阳痿命名及其病机的历史沿革探讨阳痿肾虚观的形成[J].时珍国医国药, 2011，22(2)：457-459.

[3]帕提古力·阿布拉.维吾尔医体液学说的生理学意义探讨[J].中国民族医药杂志，2008，14(6)：13-14.

[4]穆塔力甫. 维吾尔医成药学[M].乌鲁木齐：新疆人民卫生出版社,2006:355-357.

[5]阿地力江·伊明，潘建春，哈木拉提·吾甫尔，等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生殖激素的改变及其生物学意义[J].新疆医科大学学报，2012，35(11)：1439-1444.

[6]张盼盼，朱颜刘莹，阿地力江·伊明，等.伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证大鼠模型性腺轴调节作用的形态学研究[J].新疆医科大学学报，2014，37(8)：966-973.

[7]阿地力江·伊明，范强，哈木拉提·吾甫尔，等.维医异常黏液质阳痿病证动物模型的建立[J]. 中国男科学杂志，2011，25(9)：3-9.

[8]阿地力江·伊明，范强，哈木拉提·吾甫尔，等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠性行为学改变的研究[J].中国男科学杂志，2011，25(9)：20-23.

[9]朱彦刘莹，买买提祖农·买苏尔，刘凤霞，等.伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证模型大鼠阴茎组织形态学的影响[J].中国男科学杂志，2015，29(6)：9-14.

[10]Hitaley K，Webb RC，Mills TM．RhoA/Rho-kinase：a novel player in the regulation of penile erection[J].Int J Impot Res，2001，13(2)：67-72．

[11]Musani SK,Vasan RS,Bidulescu A,et al.Aldosterone,C‐reactive protein and plasma B-type natriuretic peptide are associated with the development of metabolic syndrome and longitudinal changes in metabolic syndrome components:findings from the Jackson Heart Study[J]. Diabetes Care ,2013，36(10)：3084-3092.

(本文编辑周芳)

Experimental study of hormon and morphological variation of HPA-axis of abnormal phlegmatic syndrome and impotence disease in rats model

Maowulan Maimaitiyiming1, ZHANG Panpan2, JING Yuhong3， XUE Zhiqin2,Adilijiang Yiming2, CHEN Shengguo2, LIU Fengxia2

(1DepartmentofBiology,2DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,3DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicine,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the HPA-axis variation of abnormal phlegmatic syndrome and impotence disease of rats model and discuss the posible mechanism of the disease and its development. MethodsA total of 100 healthy mature male SD rats with normal sexual function were enrolled in the study， 10 of them were randomly chosen as the control group，the other 90 were chosen as model group. The model group treated with spinach and coriander diet in a cold and humid environment until the model of abnormal phlegmatic syndrome was established．After 20 weeks of diet treatment, the model group was tested with APO erectile experiments and mating experiments, those rats have shoved impotence behavior were subdivided into abnormal phlegmatic syndrome with impotence disease group and pharmacological intervention group, while the rats have not showed impotence behavior were subdivided into abnormal phlegmatic syndrome group and pharmacological intervention group. After 2 weeks of recovery treatment to the pharmacological intervention group, the peripheral serum hormone levels was tested and hypothalamus, pituitary and adrenal gland morphology were examined for all groups. ResultsCompared with control group, the adrenaline level was increased obviously in abnormal phlegmatic syndrome group but no statistical significance (P>0.05). The norepinephrine level increased significantly in impotence model group (P<0.05), but decreased remarkably (P<0.05) after medication intervention and no significant difference was observed as compared with control group (P>0.05); in abnormal phlegmatic syndrome group, the norepinephrine level also increased apparently but no statistical significance (P>0.05). Compared with control group, the aldosterone level increased significantly (P<0.05) in impotence model group and aldosterone level is significantly increased in pharmacological intervention group than that of in control group (P>0.05). Morphological changes: (1) Hypothalamus：① control group: cellular structure and morphology are normal. ② abnormal phlegmatic syndrome group: cellular matrix loosened was observed under microscope and neuron membrane is not clear under TEM(transmission electron microscope). ③ impotence model group: cellular matrix loosened and appeared webstructure, which indicates there were edemas under microscope, and cell matrix density decreased, mitochondria in cavity changes, and rough endoplasmic reticulum expanded under TEM. ④ pharmalogical intervention group: minor repaired has been observed. (2) Pituitary: ① control group: cellular structure are normal. ② abnormal phlegmatic syndrome group: cellular matrix loosened was observed under microscope and mitochondria in cavity changes under TEM.③impotence model group: loosening of pituitary gland matrix and cellular edema were observed under microscope, and rough endoplasmic reticulum expansion under TEM. ④ pharmalogical intervention group: minor repaired has been observed. (3) Adrenal gland: ① control group: cellular structure are normal. ② abnormal phlegmatic syndrome group: hemangiectasis and decrease of cell matrix density were observed. ③ impotence model group: slight cell edema and increase of cell volume were observed under microscope and the number of mitochondria reduced under TEM. ④ pharmalogical intervention group: cell edema reduced, and the number of mitochondria increased. ConclusionSignificant changes of the hormone level and morphology of hypothalamo-pituitary-adrenal axis have been observed in abnormal phlegmatic syndrome with impotence disease rats model, and it might be the possible mechanism of the disease and its development.

Keywords:abnormal phlegmatic syndrome; erectile dysfunction; HPA-axis

[收稿日期：2016-03-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.002

中图分类号：R291.5

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0530-05

作者简介：毛吾兰·买买提依明(1972-)，男(维吾尔族)，博士，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究。通信作者：阿地力江·伊明，男(维吾尔族)，博士, 教授，博士生导师，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究， E-mail：adljym@163.com。

基金项目：国家自然科学基金(81160470)