顺铂对LTEP-a-2细胞中miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响

郑　瑛　李有杰　王萍玉　庞　敏　张菡菡　阎云飞　谢书阳

1 滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山东省高校肿瘤分子生物学重点实验室　烟台　264003；2 蓬莱市人民医院检验科



·论著·

顺铂对LTEP-a-2细胞中miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响

郑瑛1,2李有杰1王萍玉1庞敏1张菡菡1阎云飞1谢书阳1

1 滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山东省高校肿瘤分子生物学重点实验室烟台264003；2 蓬莱市人民医院检验科

【摘要】目的探讨顺铂对LTEP-a-2细胞内miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响，明确顺铂的抗癌机制。方法体外培养LTEP-a-2细胞，实验组加入不同浓度顺铂，阴性对照组为不加顺铂的细胞；倒置显微镜观察各组细胞形态，台盼蓝染色法计算细胞存活率，MTT法测定顺铂对LTEP-a-2细胞的抑制率；实时定量PCR检测miR-34b；western blot方法分析细胞中Bcl-2 及Smad3蛋白的表达变化。结果随着顺铂作用剂量的增加，LTEP-a-2细胞凋亡增加，miR-34b在顺铂作用后的细胞中的表达呈上升趋势，Bcl-2 及Smad3的表达显著下降。结论顺铂可能通过上调miR-34b的表达，进一步抑制Bcl-2 及Smad3的表达，导致LTEP-a-2细胞的凋亡。

【关键词】miR-34b；Bcl-2；Smad3；肺癌；顺铂

肺癌是最为常见的原发性的恶性肿瘤，全世界每年约有130万之多的人死于该疾病[1]，据保守估计到2025年我国每年死于肺癌的人数将上升至100万人[2]。临床统计显示，近70%就诊的肺癌患者已处于癌症中、晚期[3]，生存率极低。顺铂为重金属铂类络合物，具有细胞毒性，可抑制细胞的DNA复制过程，主要作用部位在DNA的嘌呤和嘧啶碱基上。该药特点为抗菌谱广，疗效确切，与多种抗肿瘤药物有协同作用且无交叉耐药，故为临床肺癌治疗中常规一线化疗药物，但其缺点是副作用较大。

本研究利用顺铂诱导非小细胞肺癌细胞株LTEP-a-2的凋亡，研究miR-34b、Bcl-2 及Smad3的表达变化，旨在从miRNA领域入手，探讨顺铂治疗肺癌的作用机制，寻找新的治疗靶点。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂二氧化碳培养箱(Thermo公司)；1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；MTT(Sigma公司)；顺铂(山东齐鲁制药厂)；miRNA提取试剂盒、Polymerase A试剂盒(Ambion公司)；反转录试剂盒、PCR试剂盒(大连宝生物公司)；台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(烟台赛尔斯公司)；Bcl-2、Smad3多克隆抗体(bio-world)；引物(上海赛百盛生物技术有限公司)；电泳液(烟台赛尔斯公司)；其他试剂为国产分析纯。

1.2细胞系及细胞培养人非小细胞肺腺癌细胞系LTEP-a-2，购自于中国科学院上海细胞库，细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基中，置于37℃、5%二氧化碳、95%湿度的二氧化碳恒温培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行试验。

1.3细胞形态学观察给药组细胞在给予相应浓度顺铂作用36 h后，置于倒置显微镜下观察药物处理前后LTEP-a-2细胞的形态变化。

1.4台盼蓝染色法检测细胞存活率细胞用胰蛋白酶-EDTA溶液消化2 min后，2 000 rpm离心2 min，收集沉淀细胞，弃上清。每管加入500 μL培养液吹打混匀成细胞重悬液，吸取100 μL细胞重悬液至1.5 mL EP管中，加入100 μL Trypan Blue stain 轻轻混匀，染色3 min(不宜超过10 min)，吸取少量经过染色后的细胞用血细胞计数板于倒置显微镜下观察计数。计算各实验组细胞存活率=(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100%。

1.5MTT法检测各给药浓度组LTEP-a-2细胞的抑制率取对数生长期的LTEP-a-2细胞接种于96孔培养板，每孔接种1×104个细胞加入150 μL培养液，于细胞培养箱中培养12 h，待细胞贴壁生长后加入不同浓度顺铂处理，本实验分4组，给药浓度依次为0、3、6、9 μg/mL。加药36 h后，吸掉培养液，每孔加入150 μL新鲜培养液及10 μL 0.5%MTT 溶液，5%二氧化碳培养箱中培养4 h取出培养板，小心吸掉上清液，每孔加入100 μL DMSO，于摇床上低速振荡10 min后置酶标仪上测490 nm处各孔OD值，并计算各组细胞抑制率。

1.6实时定量PCR检测LTEP-a-2细胞内miR-34b的表达变化应用miRNA提取试剂盒按说明提取小RNA；用Polymerase A试剂盒为小RNA加poly A尾后进行反转录，得到cDNA后进行实时荧光定量PCR检测细胞内miR-34b的含量。该实验以人5SrRNA作为内参，扩增5 S rRNA的上游引物序列为：5'-GCCATACCACCCTGAACG-3'；扩增miR-34b上游引物序列为： 5'-CAATCACTAACTCCACTGCC-3'；二者通用下游引物序列为：5'-AACATGTACAGTCCATGGATG-3'。反应条件设定：95℃ 5 min预变性，95℃ 10 s，60℃ 20 s，40个循环，每个循环60℃时读取各管荧光值。数据的收集与标准曲线的绘制均由仪器自带软件Rotor-Gene 6.0.41完成。

1.7Western blot检测各实验组Bcl-2 及Smad3蛋白的表达情况将收集的各加药组细胞依细胞多少分别加入适量的RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解，其间每隔10 min振荡1次，40 min后，低温离心机4℃12 000 rpm离心10 min，吸上清液于1.5 mL EP管中，加入1/4体积5×SDS loading buffer 混匀，95℃干热器加热10 min，使蛋白变性，暴露结合域；各组取10 μL上样进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳结束后，依目的蛋白及内参蛋白分子量大小切胶转膜，转膜成功后，取出PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜，加入稀释的一抗4℃摇床过夜后用TBST洗膜45 min，加入HRP标记的二抗置振荡器孵育2 h，TBST再次洗膜45 min后，加入化学发光反应混合液于暗室内曝光并拍照。

1.8统计学方法采用SPSS13.0软件进行处理，组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1顺铂作用前后细胞形态改变各给药组细胞在给予相应浓度顺铂作用36 h后，倒置显微镜下观察，随着药物浓度上升，LTEP-a-2细胞形态明显改变，活细胞数目减少，如图1所示。

2.2台盼蓝染色法检测细胞存活率吸取少量染色后的细胞于倒置显微镜下计数。本法中，有完整细胞膜的活细胞不被染色，而丧失细胞膜完整性的死细胞被染成蓝色，各组计数500个以上细胞，计算细胞存活率，如图2所示，细胞存活率随药物浓度升高而逐渐降低，说明顺铂对LTEP-a-2细胞药效显著。

2.3MTT法检测各给药组LTEP-a-2细胞的抑制率此实验结果表明，随着给药浓度的上升细胞生长的抑制率上升，细胞活力递减，如图3所示。

2.4实时定量PCR检测各组细胞miR-34b表达变化将各实验组细胞提取到的RNA经加尾、反转录生成cDNA后，以实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-34b及5S rRNA的拷贝数，以miR-34b/5S rRNA值来准确反映miR-34b的表达情况，实验结果表明当顺铂浓度大于6 μg/mL时，细胞内miR-34b的表达量明显高于阴性对照组，如图4所示。

2.5Western blot检测各组细胞内Bcl-2 及Smad3蛋白的表达变化。

有报道显示，上调miR-34b的表达可降低Bcl-2的表达，从而抑制卵巢癌细胞的存活率并促进其凋亡[4]，而Liu等[5]在对胰腺癌的研究中发现，miR-34b在mRNA和蛋白水平上皆对Smad3起着负调控的作用，因此，Bcl-2及Smad3可能为miR-34b的下游调控基因。应用western blot检测各组细胞内Bcl-2 及Smad3蛋白表达的变化，实验结果显示两种蛋白随着给药浓度的上升均呈下降趋势，如图5所示。

3讨论

miRNA(微小RNA)为近年来在真核细胞中发现的一类具有高度保守性的长约19-24 nt的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，二十年来，生命科学对miRNA的研究日趋成熟，已有众多研究表明，miRNA在细胞的各个生物学过程中发挥着重要作用，多种miRNA参与了癌基因及抑癌基因的信号调控，其表达水平与肿瘤有密切关系。据报道miRNA参与人类约30%基因的表达[6]，基于此，miRNA已成为癌症研究中的热点。本研究发现，miR-34b发挥了抑癌基因的作用，参与了顺铂抑制肺癌细胞生长的过程。

miR-34b为miR-34家族中的一员，该家族包括3个成员即miR-34a、miR-34b与miR-34c，miR-34b位于11号染色体上，有研究显示，该家族受P53直接转录调控，参与了DNA损伤修复等信号通路[7～9]，P53活化后，在转录水平上使miR-34家族高表达，导致该家族下游靶基因表达下调，从而引起细胞周期阻滞和细胞凋亡，进一步抑制细胞恶性增殖分化。

顺铂抑制肺癌细胞生长后，Bcl-2、Smad3的表达均显著降低。Bcl-2是研究最早的一类与凋亡有关的原癌基因。Bcl-2具有抑制细胞丢失，阻止细胞凋亡的功能而被称为“存活基因”[10]，目前的观点认为，Bcl-2家族是线粒体凋亡途径中的关键调节因子[11]，它通过阻止线粒体膜整合蛋白尤其是阻止细胞色素C的释放，阻断Caspase的激活从而抑制细胞的凋亡[12]。Smad3为smad家族中的受体激活型亚型的一种，该蛋白是由高度保守的MH1和MH2通过一个富含脯氨酸的铰链区相连，是把TGF-beta与其受体结合后产生的信号从细胞质转导到细胞核内的信号中介分子[13]。有研究表明，Smad3作为TGF-beta的信号传导下游产物，它的表达的调控影响着机体的多种病理生理过程，对肿瘤的发生发展至关重要[14]，阻断Smad3信号转导通路可能会影响细胞的增殖和凋亡[15]。

本研究结果显示，在顺铂作用后，miR-34b表达上调，表明该基因可能具备抑癌作用，可以抑制肺癌细胞的生长，研究还发现miR-34b调控的下游基因Bcl-2 及Smad3的表达降低。miR-34b、Bcl-2 及Smad3分子在肺癌细胞中表达的变化，有望为抗癌新药的发现提供新的思路。

参考文献

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Effect of cisplatin on MiR-34b,Bcl-2 and Smad3 in LTEP-a-2 cells

ZHENG Ying1,2LI Youjie1WANG Pingyu1PANG Min1ZHANG Hanhan1YAN Yunfei1XIE Shuyang1

1 Department of Biochemistry and Molecular Biology,Key Laboratory of Tumour Molecular Biology,School of BasicMedical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China;2 Clinical Laboratory,Penglai People's Hospital

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Cisplatin on the expression of miR-34b,Bcl-2 and Smad3 in LTEP-a-2 cells,and explore the antitumor mechanism of cisplatin.MethodsLTEP-a-2 cells were cultured in vitro.The experiment groups were treated with different concentrations of Cisplatin, while the contrast groups without Cisplatin; cells were observed under one microscope,cell survival rates were calculated by blue staining method and cell growth inhibition rates were analyzed by MTT assay;then miR-34b was amplifed by Real-time PCR and the expressions of Bcl-2 and Smad3 were detected by western blot.ResultsAfter treatment of Cisplatin,apoptotic LTEP-a-2 cells and miR-34b expression were upregulated,while Bcl-2 and Smad3 expressions were downregulated.ConclusionsCisplatin might inhibit the expression of Bcl-2 and Smad3,and induce LTEP-a-2 cells apoptosis by upregulating miR-34b.

【Keywords】miR-34b,Bcl-2,Smad3,lung cancer,cisplatin

(收稿日期：2015-09-16)

【中图分类号】R34

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0081-04

通讯作者：谢书阳, E-mail:shuyangxie@163.com

基金项目：国家自然科学基金(31440061)；山东省科技发展计划(2015GSF118073，ZR2014HL055)；滨州医学院青年骨干教师支持计划