HPLC法测定不同产地野菊花两种黄酮苷的含量

吕文文　张金杰　丁召兴　魏传梅

滨州医学院附属医院药学部　滨州　256603



HPLC法测定不同产地野菊花两种黄酮苷的含量

吕文文张金杰丁召兴魏传梅

滨州医学院附属医院药学部滨州256603

【摘要】目的通过HPLC法测定不同产地野菊花中蒙花苷与香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量，控制入药野菊花的质量。方法采用Welchrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-水-醋酸(52∶46∶2)流动相洗脱，流速 1.0 mL·min-1，检测波长334 nm，柱温为室温，进样量20 μL。结果安徽、山东产的野菊花两种黄酮苷含量较高，约为其他产地的2倍。结论不同产地野菊花中蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量差异较大，入药时应选择黄酮苷类含量较高的野菊花。

【关键词】HPLC；野菊花；含量测定；黄酮苷

野菊花为菊科植物野菊(Flos Chrysanthemi Indici)干燥头状花序，味苦、辛，性微寒，归肝心经。具有疏风清热，消肿解毒之功效。野菊花主要产于江苏、四川、广西、山东、安徽等地[1]。主要含有挥发油、萜类、黄酮类等成分[2]，黄酮类包括蒙花苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷等[3，4]。现代药理实验研究表明野菊花主要有抗菌、消炎、镇痛等功效[5，6]；黄酮类化合物抗炎镇痛作用明显，多种黄酮协同作为野菊花药效组分[7]。测定不同产地野菊花黄酮类含量，可较好地控制野菊花质量[8，9]，本研究采用HPLC法对不同产地的野菊花中蒙花苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷等两种黄酮苷类同时进行含量测定，综合评价野菊花黄酮类成分质量，建立野菊花黄酮苷类成分评价方法，更好地控制野菊花用药的有效性。

1仪器与试药

Waters 600 controller，Waters2487 Dual λ Absorbance Detector(美国waters公司)；十万分之一分析天平(日本SHIMADZU AUW120D)；数显恒温水浴锅(丹瑞 HH-D4)；粉碎机 (屹立)；甲醇(天津四友)、乙腈均为色谱级(Fisher scientific)；醋酸(国药集团)、磷酸(国药集团)均为分析纯；蒙花苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷，实验室自制 (经波谱数据鉴定，HPLC测定，归一化法计算，蒙花苷(纯度≥98.1%)，香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(纯度≥98.0%)；野菊花药材于山东、安徽、江苏、浙江、河南、湖北等各地及当地药店采集与购买。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取蒙花苷对照品2.8 mg和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品1.6 mg分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释定容，制成280 mg·L-1和 160 mg·L-1的对照品溶液。然后分别精密量取8、1 mL上述对照品溶液于25 mL容量瓶中，甲醇稀释定容，制成 89.6 μg·mL-1蒙花苷，6.4 μg·mL-1香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备将干燥的野菊花粉碎，过60目筛，精密称取粉末 0.2 g于具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇溶液150 mL，称重，浸泡过夜，加热回流3 h，放冷，称重，70%甲醇补足重量，摇匀过0.45 μm滤膜既得。

2.3色谱条件与系统适应实验色谱柱：Welchrom C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水-醋酸(52∶46∶2)；流速1.0 mL·min-1；柱温具体温度；检测波长334 nm；进样量20 μL。野菊花对照品与样品HPLC图见图1。

在此条件下蒙花苷与香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷分离度分别为R>2.2，R>2.5；理论塔板数按蒙花苷计算5 803 ，香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷7 219；拖尾因子和不对称度分别为1.002，1.009和1.039，1.037。

图1野菊花对照品与样品HPLC图

2.4线性关系分别精密吸取“2.1”项下蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品混合溶液0.5、1、2、3、5、7 mL于10 mL容量瓶中定容，HPLC进针20 μL量，测定峰面积。以进样量(X，μg·mL-1)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，制备标准曲线。蒙花苷在0.089 6～1.254 4 μg范围内和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.006 4～0.089 6 μg范围内线性关系良好，见表1。

表1　野菊花中2种黄酮苷成分的线性关系

2.5精密度取蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷浓度为8.96和0.64 μg·mL-1混合对照品溶液，连续进针6次，每次20 μL，测定峰面积。结果蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷RSD分别为0.23%，0.55%(n= 6)。表明仪器精密度良好。

2.6稳定性取“2.2”项下制备的野菊花供试液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样20 μL，测定峰面积。蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷RSD分别为1.48%，2.36%(n=6)。表明供试品溶液12 h内稳定。

2.7重复性精密称取野菊花6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，HPLC各进样20 μL，测定峰面积，计算含量。蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分别为0.91%，2.47%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.8加样回收率称取已知蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量的的野菊花6份，每份0.1 g。分别精密加入已知浓度的蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液。按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，计算含量，结果符合规定，见表2。

表2　加样回收率结果

2.9样品含量测定精密称取不同产地的野菊花，每份0.2 g，按照“2.2”项方法制备供试液，进样20 μL，在上述色谱条件下测定峰面积。用回归方程计算6批次野菊花含量，结果见表3。

表3　不同产地野菊花中蒙花苷和香叶木素

3讨论

野菊花黄酮类成分抗炎，镇痛活性较佳[10～13]，为野菊花主要活性成分，尤其以蒙花苷活性较佳，考虑以蒙花苷母核相近的一系列黄酮苷类化合物如香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷作为活性成分指标，来优选活性较好的野菊花入药。野菊花分布较为广泛，不同产地野菊花黄酮类化合物含量各有差异，为了保证野菊花用药有效性、安全性，在考察蒙花苷含量同时还要考虑其他黄酮苷类含量，为此首次选定含量较高的蒙花苷和含量较低的香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷为指标，以保证控制野菊花黄酮类成分完整性及多样性。

提取条件选择考察，《中国药典》(2010版)以纯甲醇提取，仅仅考察了蒙花苷含量，忽略了其他苷类的有效提取量，因此本实验考察了常用的不同提取溶剂，不同比例提取溶剂，不同提取方式，不同提取时间，不同的加入提取溶剂倍数等条件[14]，测定两种黄酮苷含量变化。甲醇提取时野菊花中香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷量含量较多，优选甲醇提取。考察了甲醇、80%甲醇-水、70%甲醇-水、50%甲醇-水等不同比例提取，香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量在70%甲醇左右最大量，并且蒙花苷含量降低较少，因此选用70%甲醇-水，黄酮苷类随着提取溶剂量增加而增加，因此选用500倍量溶剂，可将黄酮类提取完全。

色谱条件考察。本实验考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-醋酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-醋酸、甲醇-水-磷酸等条件，乙腈-水-磷酸各种峰分离效果较佳，但是出峰时间较长，两种黄酮苷在甲醇-水-醋酸等度条件下即可达到快速、较好分离。考察了Welchrom C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Diamonsil (4.6 mm×200 mm，5 μm)、HPLC Packed column (4.6 mm×200 mm，5 μm )不同色谱柱效果，后两者拖尾因子和不对称度较大，最终选择Welchrom C18 色谱柱(4.6×250 mm,5 μm)。考察了室温、30、35、40℃不同柱温，发现柱温增加出峰时间较短，但是蒙花苷会与其他化合物重叠，影响其分离，并且理论塔板数降低，因此选择室温。

本实验用等度洗脱可快速、简便、同时测定蒙花苷和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量，测定方法简单，快速，准确，重复性好，灵敏度高，可用于野菊花黄酮苷类化合物快速质量控制。

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Determination of the contents of two flavonoid glycosides in Flos Chrysanthemi Indici from different habitats by HPLC

LYU WenwenZHANG JinjieDING ZhaoxingWEI Chuanmei

Department of Pharmacy,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603, P.R.China

【Abstract】ObjectiveTo establish a HPLC method for determining the contents of linarin and diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside in Flos Chrysanthemi Indici from different habitats for the quality of Flos Chrysanthemi Indici.MethodsTwo flavonoid glycosides were separated on Welchrom C18(4.6×250 mm 5μm)with mobile phase consisted of methanol-water-acetic acid (52∶4∶6∶2) at a flow rate of 1.0 mL·min-1at the room temperature.The detective wavelength was set at 334 nm.ResultsContents of two flavonoid glycosides in Flos Chrysanthemi Indici from Anhui and Shandong were higher than that from Jiangsu and Henan.ConclusionsThe contents of linarin and diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside in Flos Chrysanthemi Indicifrom different habitats are quite different,we should choose the most suitable Flos Chrysanthemi Indici.

【Keywords】HPLC,Flos Chrysanthemi Indici,content determination,flavonoid glycosides

(收稿日期：2015-08-12)

【中图分类号】R93

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0120-04

通讯作者：张金杰，E-mail:zhangjinjie86@163.com