冷冻大鼠脑组织提取物的磁共振波谱分析

李　娜　王利民　董晓青

1 滨州医学院实验教学管理中心机能学实验室　烟台　264003；2 滨州医学院基础医学院人体解剖学教研室



冷冻大鼠脑组织提取物的磁共振波谱分析

李娜1王利民2董晓青1

1 滨州医学院实验教学管理中心机能学实验室烟台264003；2 滨州医学院基础医学院人体解剖学教研室

【摘要】目的比较漏斗冷冻法和直接浸入冷冻法大鼠脑组织提取物的磁共振波谱(MRS)，为进一步研究提供依据。方法成年健康SD大鼠随机分为两组，分别用漏斗冷冻法和直接浸入冷冻法取脑组织，制备高氯酸组织提取物，溶于重水(D2O)分别用31PMRS和1H MRS检测。结果31P MRS可以检测出多种含磷代谢产物，脑内PCr/Pi、ATP/Pi、ATP/EPP三组比值漏斗冷冻法明显高于直接浸入法；1H MRS可检测出N-乙酰天冬氨酸(NAA)、乳酸、肌酸及多种氨基酸，漏斗冷冻法与直接浸入法相比，NAA含量高，乳酸含量低。结论漏斗冷冻法可以较好保存脑内的能量代谢产物，脑组织提取物MRS可以检测出多种含磷和含氢代谢产物，二者结合是比较好的脑代谢研究方法。

【关键词】脑；能量代谢；磁共振；波谱

磁共振波谱(magnetic resonance Spectroscopy MRS)也称核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)波谱，在20世纪70年代就已被用于人和动物组织器官的活体检测[1，2]，是目前唯一用来在活体无损伤的检测细胞水平代谢变化的非侵入性技术。近年来，被越来越多的用于医学研究，并逐渐应用到临床某些疾病的诊断[3～6]。本文采用两种冷冻方法，制备大鼠脑组织提取物，并借助磁共振波谱检测，为临床体检提供科学的实验数据。

1材料和方法

1.1漏斗的制作取牙膏管头端金属部分，将边缘修剪成鼠头大小的椭圆形，管口固定到矿泉水瓶盖上，矿泉水瓶保留1/3。

1.2动物分组成年健康SD大鼠12只，随机等分为两组。漏斗冷冻组(A组)用漏斗法在体冷冻鼠头，直接浸入组(B组)直接在体将鼠头浸入液氮冷冻。A组大鼠正中切开颅顶皮肤，在皮肤和颅骨之间放置自制漏斗(即将牙膏管的椭圆型部分扣到大鼠颅骨上)，从漏斗中灌入液氮，迅速冷冻鼠脑；待两侧鼠眼被冷冻变白以后，提起动物将头浸入液氮，彻底冷冻；用铁锤敲开鼠头，冷冻状态取出鼠脑(含小脑)，入液氮保存。B组大鼠冷冻后同样方法取脑。

1.3脑组织提取物的制备冷冻不锈钢粉碎器，将动物脑组织移入挤压成粉末；将脑组织粉末移入预冷的研钵，加入60%高氯酸1.5 mL，并使其与脑组织充分混合，研磨成匀浆；匀浆移入离心管，-5℃，12 000 r/min，20 min；取上清液用氢氧化钾(10N)中和并调节pH值为7～8，产生KClO4沉淀。离心去除KClO4，-5℃，12 000 r /min，20 min；上清液加入Chelex-100阳离子交换树酯，充分搅拌；离心去除Chelex-100，-5℃，12 000 r /min，5 min；取上清液冷冻干燥过夜。

1.4MRS检测干燥所得固体溶于0.5 mL D2O，移入5 mm核磁管用400 MHz超导磁共振波谱仪(DRX-400，Bruker公司，9.4T)检测。1H MRS采样30 min，主要参数：谱宽30 ppm，采样延迟3 s，采样时间1.36 s，温度300 K，化学位移定标以溶剂HDO峰定位4.80 ppm。31P MRS采样过夜，主要参数：谱宽100 ppm，采样延迟2 s，采样时间1.01 s，温度300 K，化学位移以外标85%磷酸的峰为0.0 ppm。

2结果

2.1漏斗冷冻大鼠脑组织提取物的31P MRS的波谱分析大鼠脑高氯酸提取物的31P MRS波谱分析见图1。检测结果显示，波谱中各特征峰自左向右依次为：磷酸单脂峰群、无机磷(Pi)、磷酸二脂峰群、磷酸肌酸(PCr)、γ-ATP、β-ADP、α-ADP、α-ATP、NAD峰群、β-ATP。其中与能量代谢有关的有Pi、PCr、ATP、ADP，我们把这四组值之和称为可交换磷池(EPP，exchangeable phosphate pool)。两种冷冻方法的31P MRS结果比较见表1，A组的比值均高于B组，P<0.01。

注：和B组比较，**P<0.01。

2.2漏斗冷冻大鼠脑组织提取物的1H MRS波谱分析脑组织高氯酸提取物的1H MRS波谱分析见图2。可检测出多种小分子代谢产物，波谱中各特征峰自左向右依次为：乳酸(Lac)，N-乙酰天冬氨酸(NAA)，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰氨(Gln)、γ-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸(Suc)、牛磺酸(Tau)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、肌酸池(Cr，含肌酸和磷酸肌酸)。两种冷冻方法的1H MRS比较见表2。

注：和B组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3讨论

脑高氯酸提取物的31P MRS分辨率高，内容丰富，适用于多种脑部疾病的研究。其需要解决的首要问题是脑组织的快速冷冻，因为脑能量代谢特别迅速，完全缺血缺氧10 sec，脑内PCr就会丧失95%。目前文献报道有断头取脑[7]、直接浸入[8]、正压通气直接浸入[9]、漏斗冷冻法[10]4种液氮冷冻方法。断头取脑法是先取出鼠脑然后投入液氮冷冻，仅见于用1H MRS研究脑内的氨基酸代谢，因为从动物处死到脑完全冷冻所需时间太长，其间脑内高能磷酸化合物(PCr和ATP)已全部代谢掉了；直接浸入法是将鼠头或整只大鼠直接浸入液氮，彻底冷冻后再取出鼠脑。此方法难以维持脑内生活状态的高能磷酸代谢产物含量。因为动物浸入液氮后，马上窒息死亡，而从开始冷冻到大脑底部冷冻结束，约需90 s(大鼠)，但这90 s足以引起脑能量代谢产物含量的明显变化，这个通过实验已经得到证实；正压通气直接浸入法是大鼠浸入液氮前先戴一个动物呼吸器给以正压通气，但与正常通气相比有人为因素的参与。在体漏斗冷冻在七十年代就有人应用，而且证实冷冻后脑内PCr、ATP和葡萄糖明显高于直接浸入法，而乳酸、肌酸、ADP和AMP大大低于后者。此方法好处在于脑浅层冷冻时深层组织仍有血液供应，而且动物自主呼吸冷冻早期还存在，因而从一定程度上推迟了脑缺血缺氧时间，使冷冻前后脑内代谢中间产物保持不变。此方法已有人应用于NMR检测。本研究把漏斗冷冻后31P MRS的结果与直接浸入比较可见：脑内PCr/Pi、ATP/Pi明显高于后者；ATP/EPP二者相差不多。从结果可以看出，漏斗冷冻法可以较好的保存脑内的能量代谢产物，是目前研究脑代谢最可靠的方法；脑高氯酸提取物的31P MRS可以检测到脑内多种含磷代谢产物，包括磷酸肌酸、ATP、ADP、Pi、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸乙醇胺等，因而此方法可用于脑内能量代谢以及磷脂代谢的研究。

NAA是神经元特有的一种氨基酸，也是脑内含量最高的几种氨基酸之一。在正常大鼠脑高氯酸提取物1H磁共振波谱中，NAA形成的波峰最高。通常情况下，NAA是其含量仅次于谷氨酸和谷氨酰胺，高达490 μmol/100g[11]，然而它在脑内的具体功能还不清楚。文献报道，缺血时1H MRS中NAA峰减低，表示脑内NAA浓度降低，并以此作为脑细胞受损伤的标志。实验发现，两种冷冻方法的1H MRS中NAA峰都非常明显，而漏斗冷冻法的NAA/Cr值高于直接浸入法，说明前者优于后者；同时，我们发现前者Lac/Cr也明显小于后者。

细胞内NAA和乳酸含量可以用来判断脑缺血缺氧损伤的严重程度。目前在体1H MRS在脑缺血缺氧性疾病的研究中已有大量文献报道，其中大部分用NAA/Lac作为判断损伤严重程度的标志性指标。我们通过脑组织提取物的1H MRS检测发现，正常脑内NAA/Lac值为6.54±2.474，可以用于在体检测的参考。

参考文献

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Magnetic resonance spectroscopy of brain tissue extracts from freezing rat

LI Na1WANG Limin2DONG Xiaoqing1

1 Functional Laboratory,The Experimental Teaching Management Center,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China;2 Department of Human Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo compare magnetic resonance spectroscopy of brain tissue extracts after funnel freezing and direct dipping freezing.MethodsTwelve adult SD rats were divided into two groups,one frozed with funnel and another frozed by direct dipping into liquid N2.The brain tissue extracts were dissolved in 0.5 mL D2O for31P and 1H MRS analysis.Results31P MRS could reveal many phosphrus-containing metabolites of brain.The ratio PCr/Pi,ATP/Pi,ATP/EPP in funnel freezing group were higher than that in direct dipping freezing group.1H MRS could display N-acetylaspartate,lactic acid,creatine and many amino acids.There was higher content of N-acetylaspartate and lower content of lactic acid contained in funnel freezing group than in direct dipping freezing group.ConclusionsFunnel freezing method could comparatively preserve capacity metabolites.31P and 1H MRS may reveal many metabolites of brain. Integrating two methods together was a relatively perfect research way about capacity metabolism of brain.

【Keywords】brain, capacity metabolism,magnetic resonance, spectroscopy

(收稿日期：2016-01-07 )

【中图分类号】Q58

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0103-03

李娜，E-mail: wanghaojian2006@163.com