高分辨率溶解曲线分析miRNA-196a2基因多态性与肺癌相关性

商文静　庞　敏　刘　越

1 滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室　烟台　264003；2 滨州医学院附属医院麻醉科



高分辨率溶解曲线分析miRNA-196a2基因多态性与肺癌相关性

商文静1庞敏1刘越2

1 滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室烟台264003；2 滨州医学院附属医院麻醉科

【摘要】目的探讨microRNA-196a2基因多态性(rs1614913)与中国人群肺癌发病相关性。方法应用高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)分析技术对32例肺癌患者、27例肺部良性肿瘤患者及84例健康个体的microRNA-196a2基因多态性进行分析，并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术加以佐证。结果micro-196a2在各组基因型分布均达到Hardy-Weinberg平衡。肺癌组C等位基因的分布频率高于对照组(P=0.0016)，OR=2.592(95%CI 1.424～4.716)，说明C等位基因增加肺癌患病风险。结论MicroRNA-196a2 T/C (rs1614913)多态性增加肺癌的发病风险。MicroRNA-196a2基因多态性rs1614913可能是肺癌的一种有效的遗传标记物。

【关键词】肺癌；miRNA-196a2；单核苷酸多态性；高分辨率溶解曲线

肺癌是世界上严重威胁人类健康的疾病，在我国肺癌的发病率和死亡率高于其他实体瘤[1]。肺癌的形成不仅与环境因素相关，还取决于个体遗传易感性，大量研究表明有成百上千的蛋白质编码基因参与了肺癌的发生发展过程，如P53、Ras家族等。近几十年来，研究发现了许多新的肺癌治疗靶点，如EGFR[2]、LKB1[3]、KARS[4]、EML4-ALK[5]等，并且许多新的治疗肺癌的药物走向临床，如吉非替尼[6]、克唑替尼[7]、顺铂[8]等，但其五年生存率仅达到17%[9]。

microRNAs(miRNAs)，一类广泛存在的非编码RNA，可通过作用于靶基因的3＇端非翻译区加速靶基因的降解[10]。研究证明，miRNAs可以作为癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生发展中起着重要作用[11]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人类最常见的遗传变异，不仅与人类多样性的表型和疾病易感性相关，并且影响药物的反应性和肿瘤预后。miRNAs的基因多态性或突变可影响其介导的基因调控及表型，进而改变个体对疾病的易感性[12]。miRNA-196a2属于人miRNA-196家族[13]，高表达的miRNA-196a与多种肿瘤的转移及生存率有关[14]。本实验采用高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)分析技术，佐以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术，分析研究miRNA-196a2 rs11614913的单核苷酸多态性与肺癌易感性的相关性。

1对象与方法

1.1对象收集山东省烟台地区人群血液样本，并经病理确诊的肺癌病32例(肺癌组)、肺部良性肿瘤17例(良性组)，同期烟台地区的健康人85例为对照组。所有研究对象均为相互间无血缘关系的中国汉族人群，且年龄、性别、吸烟情况等信息无显著性差异。三组受检者取清晨空腹肘静脉血3～5 mL，EDTA抗凝，于-80℃冰箱长期保存，待用。

1.2方法

1.2.1全血DNA提取及检测采用酚氯仿提取-乙醇沉淀法提取全血基因组DNA，并行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用紫外线分光光度仪测定DNA纯度，OD260测定DNA的浓度。

1.2.2miRNA-196a2 PCR扩增 miRNA-196a2引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成。 扩增模板由本实验室保存，为人正常基因组DNA。其引物为：上游5＇-ACCCAGCAACCCAAAGTCTAC-3＇，下游5＇-GGTTGAGAGGACGGCATAAAG-3＇。miRNA-196a2 rs11614913的扩增片段长度为149 bp，Taq酶套装购自TaKaRa公司，反应体系体积为25 μL，含10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP2 μL，上游引物及下游引物各0.3 μL，全血DNA 0.4 μL，Taq酶0.4 μL，灭菌双蒸水19.1 μL。PCR反应循环条件为：95℃预变性5 min， 95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环，最后72℃ 10 min，保持4℃。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，-20℃冰箱保存。

1.2.3 HRM技术对miRNA-196a2 rs11614913 T-C位点基因多态性分型 步骤如下：9 μL PCR产物与1 μL LC Green于暗室中依次加入96孔PCR反应板并混匀，Mineral oil 1滴封液面； PCR反应条件为95℃ 30 s，25℃ 30 s，共1个循环，保持4℃；将96孔板4 000 rpm，30 s离心，放入Lightscanner仪器中，利用软件分析溶解曲线，得出基因型，并与酶切结果相互佐证。miRNA-196a2 rs11614913单核苷酸多态性各基因型如图1，红色曲线代表基因型TT，绿色和蓝色曲线分别代表基因型CT和CC。

1.2.4miRNA-196a2 rs11614913 T-C限制性内切酶酶切取miRNA-196a2PCR扩增产物2 μL ,用Msp1限制性内切酶1 μL ,配套10×缓冲液2 μL，加ddH2O至20 μL，37℃消化5 min。3%琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中80 V电泳40 min，溴化乙锭染色紫外凝胶成像分析系统观察酶切条带判断基因型。

1.3统计学处理应用Graphpad Prism 5 Project对数据进行分析。采用拟合优度的卡方检验(自由度为1)进行Hardy-Weinberg平衡检验，P<0.05为非Hardy-Weinberg平衡；对miRNA-196a2 rs11614913基因型及各等位基因在两组分布频率应用χ2检验，计算比值比(odds ratio，OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)以分析miRNA-196a2 rs11614913突变基因型及突变基因与肺癌发病风险关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1HRM仪统计分析基因型高分辨率溶解曲线分析仪统计如下：miRNA-196a2 rs11614913在肺癌组CC 8例，CT 17例，TT 7例，良性组CC 12例，CT 3例，TT 2例，对照组CC 48例，CT 26例，TT 10例，与酶切组数据大致相同。对miRNA-196a2 rs11614913基因在各组中基因型频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，肺癌组、良性组及对照组P值均大于0.05(分别是0.937， 0.165，0.127)，均达到Hardy-Weinberg遗传平衡。

2.2miRNA-196a2 rs11614913各基因型分布频率与肺癌发病的关系统计结果显示，与对照组相比，肺癌组各基因型分布频率具有统计学差异(P=0.0029)，而良性组各基因型分布频率没有显著性差异(P=0.5215)，见表1。

表1　miRNA-196a2 rs11614913各基因型的分布频率/n(%)

2.3miRNA-196a2 rs11614913等位基因分布频率与肺癌发病的关系数据分析显示，肺癌组各等位基因分布频率与对照组相比具有显著性差异，P=0.0016<0.05；而良性组各等位基因分布频率与对照组相比差异不明显，P=0.6312>0.05。等位基因C突变可使肺癌发病风险增加2.592倍，见表2。肺癌组携带C等位基因突变的基因型CC+CT与野生型TT相比有统计学差异(P=0.0007<0.05)，携带CC和CT基因型的人群肺癌发病风险增加4.762倍，95%CI为1.854～12.23，见表3。

表2　miRNA-196a2 rs11614913各等位基因分布频率/n(%)

表3　miRNA-196a2 rs11614913突变型和野生型比较/n(%)

3讨论

目前，多态性的研究的主要方法是聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术，本研究利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)分析我国人群中miRNA-196a2 rs11614913多态性位点，并用PCR-RELP技术加以佐证。HRM是近年来新兴的一种检测基因突变和SNP以及进行基因分型的工具。HRM技术的主要原理如下：双链DNA荧光染料与PCR产物结合后， 升温过程中SNP位点因不匹配会使双链DNA解开， 荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，实时监测荧光强度与时间曲线的关系就可以区分不同SNP位点和不同基因型[15]；其操作简便、特异性高、速度快。miRNAs能够通过与靶mRNAs特异性的碱基互补配对，引起靶mRNAs的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演重要的角色[16]。miRNA初级转录产物(pri-miRNA)、pre-miRNA或者成熟miRNAs基因序列上的单核苷酸多态性能够通过改变miRNA的表达或成熟进而改变其特性，影响miRNAs调节的细胞功能网络。研究报道，miRNA-196a2基因的多态性与心血管疾病的发生有关[17-18]，与肿瘤的发生有关。Hoffman 等[19]研究发现，转染pre-miRNA-196a-C的乳腺癌细胞表达成熟miRNA-196a的水平提高9.3倍，而转染pre-miRNA-196a-T只能提高4.4倍。Zhan等[20]通过分析结直肠癌组织中rs11614913 C等位基因的频率，发现其与结直肠癌发生的相关性。最近研究表明，Wang等[21]检测血液中miRNA-196a2 基因多态性发现其可增加食管鳞状细胞癌发病风险，并可作为一种基因肿瘤标记物。这提示，rs11614913的多态性可影响pre-miRNA的成熟过程。

本研究利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)分析血液中miRNA-196a2 rs11614913多态性位点与肺癌易感性的相关性。研究发现肺癌患者miRNA-196a2 rs11614913各基因型及等位基因分布频率与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)，该结果表明miRNA-196a2 rs11614913的多态性与肺癌易感性有关；通过统计学分析发现，miRNA-196a2 rs11614913 C等位基因是肺癌人群的优势基因型(TT/CT+CC：OR=4.762；95%CI为1.854～12.23)，而肺部良性肿瘤患者该位点的等位基因并非如此(OR=0.5556；95%CI为0.1796～1.719)，该结果表明，携带C等位基因突变的CT和CC基因型可使得肺癌发病风险增加4.762倍；而肺部良性肿瘤的发生与T/C突变无关。

采用HRM分析SNP是近年来新兴的检测手段，其特异性高、耗时短，适用于大样本统计研究。本实验结果显示miRNA-196a2 rs11614913基因多态性T-C可增加肺癌易感性，并且提示该多态性可作为一种肺癌的遗传标记物。鉴于本研究样本来源局限，本结果仅代表烟台地区部分肺癌发生情况。今后的研究需增加样本量及样本来源，以更加明确miRNA-196a2基因多态性与肿瘤发生发展的相关性。

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High resolution melting analysis of the correlation of the miRNA-196a2 gene polymorphism and lung cancer

SHANG Wenjing1PANG Min1LIU Yue2

1 Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003, P.R.China;2 Department of Anesthesia,Binzhou Medical University Hospital

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the microRNA-1962 gene polymorphism on risk of lung cancer.MethodsThirty-two patients with lung cancer,27 patients with benign neoplasm in lung and 84 healthy controls.All subjects were genotyped for the microRNA-196a2 SNP by high resolution melting analysis,and the results were supported by PCR-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThe microRNA 1962a genotype distribution among three group was in Hardy-weinberg equilibrium.The frequency of the C allele in group of lung cancer was higher than that of the control group (P=0.0016).The odds ratio 2.592 (95% CI 1.424～4.716) suggested an association of the C allele with increased risk of lung cancer.ConclusionsThe microRNA-196a2 T/C polymorphism (rs1614913) is associated with an increased risk of lung cancer.The miRNA-196a2 functional polymorphism rs11614913 might be an effective genetic marker for lung cancer.

【Keywords】Lung cancer,miRNA-196a2,SNP,HRM

(收稿日期：2015-12 -31 )

【中图分类号】R34

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0085-04

基金项目：山东省高校科技计划项目(J13LE11)

商文静，E-mail:shang0543@163.com