马铃薯早疫病拮抗菌株筛选及其抗菌活性

杨登路，雷帮星，康冀川*，韩　龙1,

(1. 贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025)



马铃薯早疫病拮抗菌株筛选及其抗菌活性

杨登路1,2，雷帮星2，康冀川2*，韩龙1,2

(1. 贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025)

摘要：为更加有效地利用微生物资源控制马铃薯早疫病，采用平板对峙法，筛选马铃薯早疫病病原菌的拮抗菌株，通过含毒介质法探究拮抗菌株的抗菌活性。结果表明：44个供试内生真菌和细菌的菌株中，7株细菌对马铃薯早疫病病原菌有显著的抑菌作用，其中菌株H3的拮抗能力最强，采用平板对峙法显示，菌株H3对马铃薯早疫病病原菌抑菌宽度为5.50 mm；对H3培养基类型进行筛选，含毒介质法显示LB发酵液的抑菌活性最高，16.7%的H3发酵液的抑制率为71.17%；菌株H3发酵液能导致马铃薯早疫病病原菌菌丝形态变化：菌丝顶端出现空泡状的膨大，菌丝隔间细胞变粗变短，原生质收缩。结果说明H3可以拮抗马铃薯早疫病病原菌。

关键词：马铃薯早疫病；菌株H3；拮抗菌株；抑菌活性

马铃薯是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。贵州是中国马铃薯生产大省，也是中国马铃薯种植最早的省份之一[1,2]。2010年马铃薯种植面积为645840 hm2，种植面积位居全国第一[3]。

马铃薯早疫病是一种对马铃薯危害比较严重的病害，在世界范围普遍发生，尤其在发展中国家被认为是仅次于晚疫病的第二大马铃薯病害。该病害由茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)引起，以危害叶片为主，同时危害叶柄、茎和块茎。因病原菌侵染叶片和损伤块茎，造成马铃薯减产和储藏期的腐烂。在马铃薯早疫病的防治方法中，主要采取选择抗病品种、农业栽培措施和化学农药防治等措施。目前，在防治措施中以化学防治为主，但问题是农药残留危害人、畜健康，污染土壤和水体，破坏生态平衡[4]。因此，具有无毒、无害、无污染、不产生抗药性的生物防治技术，比较符合人们对绿色食品的需求，并且为农业的可持续发展提供了保障。利用微生物及其代谢产物控制植物病害已有许多成功的报道，但对马铃薯早疫病的研究还不多见[5]。

本文通过对马铃薯早疫病拮抗微生物菌株进行筛选以及对拮抗菌株发酵液的抑菌效果进行研究，为清楚该菌株对马铃薯早疫病防病机理和产业化应用提供前期基础。

1材料与方法

1.1试验材料

35株青蒿内生真菌，由贵州大学生化工程中心实验室分离保存。9株细菌由贵州大学生化工程中心分离保存，经鉴定，H3菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。马铃薯早疫病菌(Alternaria solani Sorauer)，购自中国农业微生物菌种保藏中心(菌株编号：37458)。

1.2培养基

1.2.1种子培养基葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母膏5 g、NaCl 10.4 g、KH2HPO40.03 g、CaCl20.02 g、MgSO4·7H2O 0.02 g，pH7.0～7.2，121℃、0.1 MPa灭菌30 min。

1.2.2发酵培养基LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基(NB)、发酵基础培养基(1%葡萄糖、0.3% K2HPO4、2% 酵母粉、pH 7.0～7.4)、BPY培养基[6]。

1.2.3马铃薯葡萄糖琼脂培养基将马铃薯洗净去皮切碎，称取200 g加水1000 mL煮沸，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和18 g琼脂，分装，121℃灭菌20 min。

1.3方法

1.3.1 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙法测定供试菌株对马铃薯早疫病病原真菌的抑菌作用。细菌：在PDA平板中央接种病原真菌,四周接种拮抗细菌,以不接种细菌的作为对照;真菌：在PDA平板两侧分别接种供试真菌和病原菌，相距2.0 cm，以不接种供试真菌作为对照[7]。重复三次，置于28℃培养箱培养，当对照组病原真菌长至培养皿边缘时,观察并记录实验组有无抑菌圈产生并测量抑菌圈直径。

1.3.2菌株H3发酵液制备

(1)菌种活化：将4℃冰箱内斜面保存的菌株H3通过划线法接种于LB上，30℃培养24 h，连续转接2-3次。

(2)发酵液的制备：将已活化的菌株H3接种于装有种子培养基的三角瓶中(三角瓶内培养基的装液量为40%)，150 r/min，30℃摇床振荡培养48 h。2%接种量接种于发酵培养基中，培养条件同上，得到发酵液，将发酵液于高速离心机内4500 r/min离心15 min，收集上清液在微孔滤膜过滤器中过滤，得菌株H3发酵液，备用。

1.3.3含毒介质法探究拮抗菌株的抗菌活性

将发酵液与培养基以1∶5体积比混合。以加等量的无菌水的培养基为对照，采用含毒介质法(生长速率法)测定其抑菌效果。计算方法如下：

D=D1-D2×I=(D0-D)/D0×100%

D-菌落增长直径，I-菌丝生长抑制率，D1菌落直径，D0-空白对照菌落增长直径，D2-菌饼直径。

1.3.4检测拮抗菌发酵滤液对病原菌形态的影响

将活化的病原真菌接种于PDA固体培养基中央，28℃下培养48 h后在菌落边缘用6 mm直径打孔器打孔，菌株H3的发酵液注入孔内，每孔100 μL，用未接菌的LB液体培养基作空白对照，每处理3次重复，28℃培养48 h，挑取抑菌带边缘的马铃薯早疫病病原菌菌丝，显微镜下观察菌丝形态[9]。

1.3.5不同培养基对菌株H3抗菌活性的影响

将拮抗菌株H3活化后用接种环挑取菌株单菌落接入种子培养基中，装液量100 mL(250 mL三角瓶)、初始pH 7.0，30℃、150 r/min振荡培养24 h。以2%接种量分别接种到马铃薯液体培养基、LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、发酵基础培养基、BPY培养基，空白对照接种无菌水，30℃、150 r/min条件下振荡培养48 h。取20 ml发酵液加入到100 ml PDA中(1∶5)，通过含毒介质法检测不同培养基发酵液的抗菌活性。

1.3.6不同浓度发酵液对早疫病病原菌的抗菌活性

以筛选出的液体培养基LB作为基础培养基。在体系为100 ml的PDA中加入不同量的发酵液，使发酵液的浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%，通过含毒介质法测定不同浓度发酵液的抗菌活性。

2结果与分析

2.1不同菌株对马铃薯早疫病的拮抗能力

供试的青蒿内生真菌中，通过平板对峙法没有与病原菌产生抑菌圈的现象，说明青蒿内生菌对马铃薯早疫病无明显的拮抗作用。供试的细菌中有7株细菌有明显的抑菌作用(表1)，菌株H3对马铃薯早疫病病原菌的抑制作用最好，抑菌宽度5.50 mm。(如图1)。

表1　9株细菌对马铃薯早疫病病原菌的抑制作用

图1　菌株H3对马铃薯早疫病病原菌的平板对峙试验

2.2拮抗菌发酵滤液对病原菌的影响

挑取空白对照孔和发酵菌液孔周边的菌丝分别在体式镜和显微镜下观察。体式镜下，正常菌丝分布均匀，平铺在培养基上，发酵液周围菌丝，厚而致密，棉絮状缠绕在一起。显微镜下正常菌丝光滑、透明、粗细均匀，原生质分布均匀。抑制菌丝顶端出现空泡状的膨大，菌丝隔间变粗变短，细胞原生质浓缩(图2)。

图2　H3发酵液对病原菌菌丝的影响

2.3不同培养基发酵液的抗菌活性

发酵基础培养基、LB、NB、PDB、BPY发酵液的抑菌率分别为40.78%、71.17%、65.00%、69.35%、70.12%(表2)。对于不同培养基，H3产生的物质存在差异性而且对马铃薯早疫病的抗菌活性差异显著。以上培养基中LB液体培养基最有利于抗菌物质的产生。

表2　菌株H3的不同培养基发酵液对早疫病病原菌的抑制率

注：结果为平均值c标准误，同列数据后不同小写字母表示各处理间差异显著(p<0.05)。

图3　H3不同培养基发酵液抑菌活性(a.空白；b.PDB；c.NB；d.BPY；e.LB；f.发酵基础培养基)Fig.3　Antimicrobial activity of strainH3 in differentculture brothagainst Alternaria solani

2.4不同浓度发酵液对早疫病病原菌的抗菌活性

以筛选出的LB液体培养基作为基础培养基。发酵液浓度为10%、20%、30%时，抑制率分别为78.48%、80.06、80.38%，没有显著差别。当发酵液浓度到达40%以上时，抑菌率才有明显的提高。说明可能在40%以下的浓度时，抑菌物质的量还不能够累计到达一定的量引起抑菌率的变化。当发酵液浓度到达60%时，抑菌率基本到达100%。

表4　不同浓度梯度发酵液的抑菌率

图4　不同浓度发酵液抑菌效果

3结论与讨论

茄链格孢菌在自然界寄主种类多，分布广泛，常形成不同的生态类型,即使分离自同一寄主植物的不同菌株之间也往往在生物学性状与致病力方面存在显著差异[13]。分离自马铃薯的茄链格孢的相关文献并不多，分离自其他作物的茄链格孢菌研究较多,包括对生物学性状、致病力、产孢条件、抗病育种、化学防治等均有较多报道[10],对其拮抗菌的筛选也已有报道[5，10，11]。目前对于马铃薯早疫病菌多样性、生物学特性、致病力分化及其侵染过程已有相关文献报道[12-13]。但是枯草芽孢杆菌作为生防菌对马铃薯早疫病的研究也还不多见[5]。

该试验从保存具有广谱性抗菌的内生真菌和细菌的44个菌株中，筛选出的菌株H3。经鉴定，菌株H3为枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)对马铃薯早疫病具有良好的抗菌活性。通过平板对峙法，菌株H3的抑菌宽度为5.50 mm。LB作为基础培养基的H3发酵液(发酵液∶培养基=1∶5)的抑菌率为71.17%。通过平皿打孔抑菌试验可以发现发酵液对菌丝具有抑制作用，并且改变了菌丝的形态：抑制菌丝厚而致密，棉絮状缠绕在一起，抑制菌丝顶端出现空泡状的膨大，菌丝节间变粗变短，原生质收缩。这些现象都表明其细胞壁结构受到了破坏,可见发酵液对茄链格孢细胞壁的损伤是明显的，细胞质中出现空泡也表明细胞内结构也遭到破坏。因此，发酵液在破坏外层细胞壁后,也使细胞质中的物质基础如脂质体等发生变化或者损伤,最终达到抑制效果。这与唐福星[14]等用山苍子精油处理黑曲霉(Aspergillus nigervan)可干扰其细胞壁的生长，阻断代谢途径，最终达到抑菌效果的观点相同。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质主要为低分子抗菌肽，包括分子量约在1000 Da的环状肽、环状脂肽和线状肽，也有些大分子的蛋白类拮抗物[15]，抗菌物质的确定需要进一步研究。本文对筛选出的菌株H3对马铃薯早疫病的抗菌活性进行初步探究。随着进一步对菌株H3发酵优化以及培养条件的优化，菌株H3对于马铃薯早疫病的拮抗作用必将得到提升。研究表明菌株H3可以作为马铃薯早疫病的生防菌，值得深入研究。

参考文献

[1]中国农业年鉴编辑委员会. 中国农业年鉴[M]. 中国农业出版社, 2011: 216.

[2]李晶, 杨谦. 生防枯草芽胞杆菌的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008,36(1):106-111.

[3]刘振业. 贵州马铃薯产业现状和发展优势与潜力[J]. 贵州农业科学, 2005, 33(3): 5-8.

[4]罗征文. 贵州年鉴[M]. 贵阳：贵州年鉴社, 2010.

[5]高芬, 马利平, 乔雄梧. 对番茄早疫病拮抗菌的筛选[J]. 山西农业科技, 2001, 29(3): 64-66.

[6]冯书亮, 王容燕, 林开春, 等. 拮抗细菌Bs-208菌株鉴定及对几种植物病原菌的抑菌测定[J]. 中国生物防治, 2003, 19(4): 171-174．

[7]刘焕利,潘小玫,张学君,等.产抗菌蛋白芽孢杆菌的筛选及抗菌蛋白性质[J].中国生物防治,1995,11(4):160-164.

[8]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社, 1998.

[9]易有金, 刘如石, 尹华, 等. 烟草青枯病拮抗内生细菌的分离、鉴定及其田间防效[J]. 应用生态学报, 2007, 18(3): 554-558.

[10]王连平,王汉荣,茹水江,等.浙江省番茄早疫病菌生物学特性研究[J].浙江农业学报,2002,14(6):320-325.

[11]张子君,李海涛,邹庆道,等.不同培养基对番茄早疫病菌菌丝生长的影响[J].辽宁农业科学,2007(4):17-18.

[12]郑寰宇.马铃薯早疫病菌生物学特性及致病分化的研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学,2010.

[13]台莲梅.马铃薯早疫病菌多样性和侵染过程及品种抗病机制研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学,2011.

[14]唐福星，罗曼,蒋立科.山苍籽油抗食品中黑曲霉机理的初步研究[J].食品科学, 2003, 24 (9): 41-43.

[15]任建军.枯草芽孢杆菌RN-61抗菌蛋白的纯化及鉴定[D].北京：北京林业大学,2013.

The Screening of Antagonistic Strains to Potato Early Blight and Detection of Antimicrobial Activity

YANGDeng-lu1,2,LEIBang-xing2,KANGJi-chuan2*,HANLong2

(1.CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.EngineeringResearchCenterofSouthwestBio-PharmaceuticalResources,MinistryofEducation,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:In order to control potato early blight by microorganisms, plate confrontation tests were used to screen antagonistic strains, then the antimicrobial activity were detected in the current work. Among the 44 strains of endophytic fungi and bacteria, seven bacterial strains gave a significantly inhibitory effect against pathogen, off which strains H3 demonstrated the highest antagonistic ability, whose antibacterial circle diameter was 5.50mm. Antimicrobial activity of strain H3 broth in LB was the highest, and strain H3 broth with 16.7% concentration gave 71.17% inhibition rate. Strain H3 broth cause the abnormality of pathogenmycelium, i.e. the apical expansion to vacuole-like sphere, the thicker and shortersection between hyphaeseptum, as well as the shrinked protoplast. Therefore, strain H3 could better control potato early blight.

Keywords:Potato early blight；Strain H3；Antagonistic strains；Antimicrobial activity

文章编号：1008-0457(2016)01-0062-05国际DOI编码：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.013

中图分类号：S571.1

文献标识码：A

*通讯作者：康冀川，男，教授，博士生导师，主要研究方向：分子生物学和真菌学；E-mail:bcec.jckang@gzu.cn。

基金项目：贵州省农业攻关项目“植物内生菌抗马铃薯真菌病害及其生防制剂的研究”黔科合NY[2013]3042号。

收稿日期：2016-02-15；修回日期：2016-02-07